[发明专利]一种轮状病毒滴定方法

说明书

本发明提供了一种对轮状病毒滴度进行测定的方法。具体地，本发明的方法将待测定的轮状病毒、可被所述轮状病毒感染的宿主细胞、和培养液同时置于检测孔中，使用带有可检测标记的抗轮状病毒抗体，通过直接免疫荧光法测定待测定轮状病毒的滴度。本发明的方法操作简便，灵敏度更高，准确性更好，是一种快速高效的轮状病毒滴定方法。

技术领域

本发明涉及生物医药领域,具体地,涉及一种轮状病毒的滴定方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)是一种感染范围极广的消化道病毒，其中的A组RV是引起婴幼儿腹泻的主要病原之一。全世界每年因RV感染导致的婴幼儿死亡大多数发生在发展中国家。在我国，0～2岁的婴幼儿人数约为4000万人(含新生儿)，每年大约有1000万婴幼儿患RV感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。RV疫苗免疫可以显著的降低婴幼儿因RV感染而造成的重症腹泻的比例。

对RV的病毒定量方法主要包括q-PCR，ELISA和基于细胞的滴定法三种。Q-PCR是通过对病毒基因组的定量间接确定病毒的含量；ELISA是通过定量病毒的主要结构蛋白间接确定病毒含量；基于细胞的滴定法是对感染性病毒粒子的数量进行测定的方法。

对于RV疫苗的生产，尤其是口服RV疫苗，感染性病毒的滴度才是影响疫苗免疫效果的最关键指标。由于RV的融合素蛋白VP4在胰酶作用下才能高效的裂解为带氨基末端的VP8和带羧基末端的VP5，而这两个片段在病毒入侵宿主细胞的初期起着重要的作用；因此，胰酶在RV的体外扩增和滴定中都具有重要应用。

目前已有的RV的Vero细胞滴定方法主要是先将Vero细胞铺于96孔板中过夜培养，让后用PBS将细胞洗涤3-5遍，确保没有FBS，然后添加一定浓度的胰酶到病毒液中，梯度稀释接种于细胞中，然后通过抗原抗体反应来确定病毒滴度，整个过程大约96h；这种方法检测时间长，且使用含血清培养基，需要在接种RV时对胎牛血清进行彻底清洗，在对阳性细胞计数的时候使用两种抗体，操作繁琐，成本较高。

因此，本领域亟待开发一种快速高效的轮状病毒滴定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速高效的对轮状病毒滴度进行测定的方法。

本发明的第一方面，提供了一种对轮状病毒滴度进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：

(S1)将待测定的轮状病毒、可被所述轮状病毒感染的宿主细胞、和培养液置于检测孔中，形成培养体系，其中，在所述检测孔中宿主细胞的接种量为1.0×10⁶-1.5×10⁶个/cm²检测孔的底面积；

(S2)对所述培养体系在适合所述轮状病毒感染和复制的情况下，培养一段时间t1，从而获得受轮状病毒感染的贴壁宿主细胞，其中t1为12-22小时；

(S3)将所述受轮状病毒感染的贴壁宿主细胞进行固定处理，从而获得经固定的受轮状病毒感染的贴壁宿主细胞；

(S4)将所述经固定的受轮状病毒感染的贴壁宿主细胞与抗轮状病毒抗体进行接触，并持续一段时间t2，形成“轮状病毒-抗轮状病毒抗体”的复合物，其中，所述的抗轮状病毒抗体带有可检测标记，t2为0.5-2小时；和

(S5)基于所述“轮状病毒-抗轮状病毒抗体”的复合物，定量检测所述检测孔中的轮状病毒的数量，从而获得所述轮状病毒滴度的测定结果。

在另一优选例中，在步骤(S1)中，包括n个检测孔，n为≥3的正整数，较佳地n为6-96。

在另一优选例中，在步骤(S1)中，所述的检测孔包括一组或多组的系列检测孔，在一组系列检测孔中，各个检测孔除了轮状病毒的数量不同之外，其他条件相同(包括含有相同数量的宿主细胞、和相同成分和体积的培养液、相同的胰酶和胰酶浓度、相同的添加成分等)。