[发明专利]一种筛选特异BCR/TCR的方法及其系统

说明书

本发明公开了一种筛选特异BCR/TCR的方法及其系统。该方法包括以下步骤：筛选特异性BCR/TCR的方法，包括以下步骤：(1)提取免疫后的待测样本淋巴细胞中的mRNA；(2)逆转录处理步骤(1)所得mRNA后，再对其BCR/TCR可变区基因进行多重PCR扩增，然后进行高通量测序，并确定BCR/TCR可变区的核酸及氨基酸序列；(3)将测序得到的序列与未经抗原刺激样本的淋巴细胞BCR/TCR测序结果对比，获得相应的特异性免疫序列。本发明通过免疫图谱大数据进行对比，同时比较巨大数量的BCR/TCR序列，具有更高的特异性和准确性，可以极大提高抗体及T细胞受体筛选鉴定的效率，且筛选成本低。

技术领域

本发明属于分子生物学和细胞免疫学技术领域，具体涉及一种筛选特异性抗体(BCR)及T细胞受体(TCR)的方法及其系统。

背景技术

单克隆抗体，是由单一B细胞产生的高度均一、识别特定抗原表位的抗体。单克隆抗体在医学与生物学基础研究，以及临床疾病的诊断、预防和治疗中都有广泛的应用前景。要得到针对特定抗原的单克隆抗体，需要进行抗体筛选。现有比较成熟的单克隆抗体筛选技术有：

1、杂交瘤技术。

将抗原免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖。将融合的杂交细胞分成单细胞接种培养，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法筛选鉴定增殖后细胞分泌的抗体，找到能产生针对抗原具有高滴度抗体的细胞株，再从其中克隆出该抗体的基因序列。

杂交瘤技术的主要缺点是，后期鉴定过程需要进行大量重复性的培养、分离、鉴定实验，带来的是高昂的时间和物质成本。

2、噬菌体展示筛选技术。

将B淋巴细胞的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)采用PCR方法进行扩增，将扩增的片段插入到噬菌体载体中，抗体分子以Fab片段或者单链抗体(scFv)的形式，与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，从而展示在噬菌体表面。之后将噬菌体转染至宿主细胞中进行增殖，待成熟后释放出来，最后利用抗原筛选的方法经过亲和吸附、洗脱、扩增等步骤后即可获得靶抗原特异性的噬菌体及对应单克隆抗体。

为了得到更接近人源抗体的抗体进行筛选，还有酵母表面展示技术、核糖体展示与mRNA展示筛选技术等，其方法与噬菌体展示筛选类似。各种展示技术筛选抗体的缺点与杂交瘤技术类似，后期鉴定过程工作量大，时间和物质成本高。

3、单细胞克隆技术。

先通过流式细胞分析等方法，筛选出表面受体能识别特定抗原的B淋巴细胞或T淋巴细胞。再直接从单个B细胞或T细胞中，克隆出它携带的B细胞受体(BCR，分泌到体外即为抗体)或T细胞受体(TCR)基因。

单克隆技术的缺点有两方面：一方面，单个淋巴细胞表面的BCR或TCR数量有限，这就限制了利用抗原分选单细胞的灵敏度和特异性，分选出的细胞不能确保必然是阳性细胞，后期仍然需要对得到的抗体/TCR进行比较多的鉴定；另一方面，单细胞克隆的难度较高，对细胞的质量、操作人员的技能、试剂的品质都有很高要求。

现有单克隆抗体筛选技术还有三个显著的不足：第一是对于人源抗体的筛选比较困难，因为无法像免疫动物一样使用抗原和佐剂对人体进行反复免疫。如果使用转基因小鼠(携带人源免疫球蛋白基因)，则成本会更高。这就使得制备人源抗体要么需要在筛选鉴定中投入更多资源，要么需要对动物抗体进行人源化。

第二是对针对复杂抗原制备单克隆抗体存在困难。当需要针对较大较复杂的抗原(如膜蛋白复合物、肿瘤细胞等)制备抗体时，选择制备用于免疫的抗原本身就有较大难度且存在失败风险，而免疫后也不能保证得到功能上满足要求的抗体(如选择多肽段免疫所得抗体，未必是中和抗体)。如果同时选取多种抗原进行免疫和筛选，则会显著提高单克隆抗体制备的成本。

第三，需要确定抗原进行筛选鉴定