[发明专利]定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法

权利要求书

1.一种定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，将以牛乳过敏原酪蛋白作为免疫抗原分别免疫分别新西兰大白兔和BALB/c小鼠获得的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体，并分别对其性能进行鉴定评价，然后将两者进行夹心配对，从而建立定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法。

2.根据权利要求1所述的定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述的双抗体夹心ELISA检测方法，包括：酪蛋白最优捕获抗体的筛选、酶标二抗工作浓度的优化、酪蛋白兔多抗工作浓度的优化和标准曲线的建立；

所述的标准曲线以酪蛋白标准品浓度为横坐标，以吸光度OD₄₅₀为纵坐标，以酪蛋白标准品浓度(ng/mL)为横坐标，并将横坐标设置成对数形式，利用Origin软件中的logistic模型进行四参数拟合，绘制标准曲线，通过P/N(阳性/阴性)＞2.1来计算酪蛋白的LOD。

3.根据权利要求2所述的定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，酪蛋白最优捕获抗体的筛选、酶标二抗工作浓度的优化和酪蛋白兔多抗工作浓度的优化采用以下方法：

(1)包板：ELISA板的微量滴定孔用100μL捕获物包被抗体—鼠单克隆抗体，以5μg/mL包被，于4℃过夜，或37℃恒温烘箱孵育2h；

(2)洗板：接着用PBST重复洗涤三遍以除去未结合的抗体，拍干；

(3)封闭：每个孔中加200μL封闭缓冲液；

(4)加样品：用12孔排枪将稀释好的酪蛋白标准品加入96孔酶标板中，每孔加液量为100μL，置于37℃恒温烘箱中孵育30min；

(5)加兔抗血清：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，取100μL检测抗体—兔多克隆抗体，在稀释缓冲溶液液PBS中稀释一定倍数后，将其加入到每个孔中，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；

(6)加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，按照与先前步骤相同的方式，将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体—酶标二抗稀释至一定倍数后，加入孔中，每孔加液量为100μL，并在37℃恒温烘箱中孵育30min；

(7)显色：按照步骤(2)操作步骤洗板，拍干后，最后将新鲜配制的TMB底物显色溶液添加到每个孔中，100μL/well，在37℃恒温烘箱中孵育15min；

(8)终止：反应用2M H₂SO₄终止，每孔加液量为50μL，吸光度值为测定450nm。

4.根据权利要求3所述的定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，酪蛋白最优捕获抗体的筛选和酶标二抗工作浓度的优化的过程中：

将鼠单克隆抗体作为捕获抗体包被酶标板，控制包被浓度、酪蛋白标准品稀释和兔多克隆抗体稀释浓度不变，用磷酸盐缓冲液将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体稀释为1:5000、1:10000和1:15000三个梯度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，通过测定OD₄₅₀，确定酪蛋白最优捕获抗体和酶标二抗工作浓度。

5.根据权利要求4所述的定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法，酪蛋白兔多抗工作浓度的优化过程中：

按照确定的酪蛋白最优捕获抗体和酶标二抗工作浓度进行操作，对兔多克隆抗体进行最优稀释倍数的确定，将其稀释为1:10000、1:15000和1:45000三个梯度，以未加标品的磷酸盐缓冲液作为阴性对照，通过测定OD₄₅₀，确定酪蛋白兔多抗工作浓度。

6.根据权利要求2所述的定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，标准曲线线性范围为80-1280ng/mL，检出限为80ng/mL；该方法对酪蛋白检测的批内变异系数CV在2.72-5.97％之间，批间变异系数CV在7.99-12.33％之间，具有较高的精密度；该方法只与酪蛋白发生交叉反应；该方法对酪蛋白的回收率为80.4-92.25％。