[发明专利]一种高纯度重组水蛭素的纯化方法

权利要求书

1.一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1预处理：先将酵母菌分泌表达的重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5~3.5进行酸沉，再取上清液加热至80℃ 恒温保存10min，得到粗提水蛭素，再立即用冰水降温，得到粗提重组水蛭素；

S2疏水色谱分离：以苯基键合硅胶为色谱柱（粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm）填料，取粗提重组水蛭素以80 mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80 mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120min：100%→0%流动相A，0%→100%流动相B；其中，流动相A为pH值为5.0的氯化钠-磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为1 mol/L，磷酸盐的浓度为50 mmol/L，流动相B为pH值为5.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线第二次上升时开始收集主要洗脱峰部分直至吸收峰下降回到基线，得到重组水蛭素洗脱液I；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液I洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再生液I为80%乙醇；再用2倍柱体积的流动相B清洗，除去多余的有机溶剂乙醇，最后用5倍柱体积的流动相A清洗，完成苯基键合硅胶色谱柱的再生；

S3阴离子交换色谱分离：以DEAE键合硅胶为色谱柱（粒径5μm，孔径300埃，直径40mm×长度500mm）填料，取重组水蛭素洗脱液I以80 mL/min的流速进样，先用5倍柱体积的流动相A进行柱平衡，再用流动相A-流动相B以80 mL/min的流速进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0-120 min：100%→0%流动相A，0%→100%流动相B；其中，流动相A为pH值为7.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为300 mmol/L，Tris-HCl的浓度为10 mmol/L；用紫外检测器采集信号，检测波长为UV 254nm，当基线上升时收集主要的洗脱峰部分，得到重组水蛭素洗脱液II，最后进行冷冻干燥，即得高纯度重组水蛭素；洗脱结束后用5倍柱体积的再生液II洗脱色谱柱，去除分离介质表面强吸附的杂质组分，再用5倍柱体积的流动相A清洗，完成色谱柱的再生；其中，再生液II为pH值为7.0的NaCl-Tris-HCl缓冲液，NaCl的浓度为1 mol/L，Tris-HCl的浓度均为10 mmol/L。