[发明专利]一种高纯度重组水蛭素的纯化方法

说明书

本发明涉及生物医药的分离技术领域，具体涉及一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。本发明结合疏水层析和阴离子交换层析两种液相色谱，通过梯度洗脱实现重组水蛭素与杂质组分的分离，有效去除重组水蛭素发酵液中的内毒素和宿主蛋白，制得高纯度高比活的重组水蛭素，本发明的方法选择性好、分辨率高、分离速度快，避免了有机溶剂对人体和环境的危害，降低了成本，稳定性和安全性好，适用于大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药的分离技术领域，具体涉及一种高纯度重组水蛭素的纯化方法。

背景技术

水蛭是我国传统中药，始载于《神农本草经》，具有破血、逐瘀、痛经之功效。从水蛭唾液腺里提取的水蛭素是一种抗凝血蛋白质，其对凝血酶具有极强的抑制作用，可用于抑制纤维蛋白原和血小板在损伤血管内的积累、预防血栓形成、治疗弥散性血管内凝血等疾病。相比肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物，水蛭素具有用量小、疗效高、不良反应少、安全性高等优点，具有很好的临床应用价值。

天然水蛭素是由65-66个氨基酸残基组成的单链环肽化合物，分子量约为7000Da，其中N末端有3对二硫键，可绕叠成密集的环肽结构，其疏水结构域与凝血酶催化中心附近的非极性结合点互补，对蛋白质起稳定作用，而C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。由于水蛭素在水蛭中的含量有限，从水蛭中难以提取大量水蛭素，不能满足临床的使用要求，因而通过基因工程重组水蛭素成为国内外医药界的研究重点。重组水蛭素在第63位氨基酸Tyr残基上脱SO^3-，其余结构与性质跟天然水蛭素基本相同。

最早的重组水蛭素cDNA已于20世纪80年被成功克隆出来，至今重组水蛭素已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌及真核细胞等成功表达。如专利CN1420176A中合成的水蛭素基因在酵母工程菌中中获得了高水平表达，且发酵液中蛋白纯度较高。公开号为CN110684101A的专利申请提供的重组水蛭素的制备方法，可以得到大量分泌菌体，提高活性产物的表达。

然而，目前的研究重点主要在重组水蛭素的制备和表达方面，而对进一步的分离和纯化研究则相对较少。传统将发酵液加热后放入发酵罐中的处理方式不适于工业化生产，并且采用低温离心去除杂质的可操作性差，且蛋白纯度低、色素含量高。公开号为CN106834395A的专利申请利用发酵液上清液通过pH调节和上罐加热的处理方式，提高了重组水蛭素的蛋白纯度，并采用低温静置过滤去除杂蛋白和脂类物质，但该方法分离流程复杂，且静置分离的效率太低，总活性回收率也较低。公开号为CN104761635A的专利申请采用了膜过滤结合色谱分离技术对天然水蛭素进行分离纯化，但分别采用陶瓷滤膜、有机滤膜和纳滤膜过滤不仅导致水蛭素活性回收率偏低，而且其中纳滤膜起到浓缩作用，但纯度并未提高，并降低了水蛭素的疏水性，在纳滤后再经过反相色谱洗脱，大大降低了水蛭素在反相色谱柱上的吸附作用力，严重影响分离效果。此外，目前反相色谱分离大多采用乙腈、甲醇等有机溶剂，不仅会破坏蛋白质分子结构，导致活性损失，还可能存在溶剂残留，对人体和环境都造成危害。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种简单高效、节能环保且适用于大规模工业化生产的重组水蛭素的纯化方法，可制得具有高纯度、高比活、高回收率的重组水蛭素。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相；阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基(DEAE)键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。