[发明专利]一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

（1）扩增缓冲液：包括针对P. jirovecii线粒体大亚基设计的一对特异性扩增引物（上游扩增引物SEQ ID NO.1、下游扩增引物SEQ ID NO.2），dNTP，NTP，ITP，DTT，二甲基亚砜DMSO，氯化镁，氯化钾，山梨醇，牛血清白蛋白（BSA）；其中，上游扩增引物SEQ ID NO.1序列为TGCGAAAATTGTTTTGGCAA，下游扩增引物SEQ ID NO.2序列为aattctaatacgactcactatagggaga TCTACCTTATCGCACATAGTCTGA；

（2）扩增酶：包括逆转录酶AMV，T7 RNA聚合酶和RNA酶H；

（3）检测缓冲液：包括针对P. jirovecii线粒体大亚基设计的一条特异性检测探针（SEQ ID NO.3），荧光报告探针（SEQ ID NO.7），NTP，DTT，氯化钠，氯化镁；其中，SEQ IDNO.3序列为taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacAATCTCAAAATAA CTATTTCTTAAAATAA；SEQ ID NO.7序列为FAM-/i2OMeA/AUGGC/i2OMeA/-BHQ1；

（4）检测酶：包含Cas13a，T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂；

（5）矿物油；

（6）质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。

2.根据权利要求1所述试剂盒，所述特异性检测探针SEQ ID NO.3经过检测酶在检测缓冲液中反应后产生crRNA，可以与Cas13蛋白结合并特异性的识别靶向RNA序列，其crRNA序列（SEQ ID NO.4）序列为gaUUUagacUaccccaaaaacgaaggggacUaaaacAAUCUCAAAAUAACUAUUUCUUAAAAUAA。

3.根据权利要求1所述试剂盒，所述荧光报告探针为一段单链RNA序列，其5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求1所述试剂盒，下游扩增引物5’端包含一段含有T7启动子的序列SEQID NO.5，其序列为aattctaatacgactcactatagggaga。

5.根据权利要求1所述试剂盒，所述特异性检测探针包含一段T7启动子序列SEQ IDNO.6，用于T7 RNA聚合酶的作用下产生crRNA，其序列为taatacgactcactataggg。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于具体试剂组成如下：

（1）扩增缓冲液：10-100mM Tris-HCl pH7.5-pH8.5，扩增引物0.1~2μM，dNTP 0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1~10 mM DTT，0-25%v/v二甲基亚砜（DMSO），2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白（BSA）0.1-100μg/反应；

（2）扩增酶：逆转录酶AMV 0.5-100U/反应，T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，RNA酶H 0.02-5U/反应，20-300 mM Potassium Phosphate, pH 7.5，1-10 mM Dithiothreitol (DTT)，20-50%v/v甘油，0.01%-1% Triton X-100，20 -100mM Tris-HC1，pH 7.5，0.01-0.5mMEDTA，20-200 mM NaCl，20~200mM KCl；

（3）检测缓冲液：特异性检测探针crDNA 1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mMNTP，1-20 mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾， 1%-25%v/v聚乙二醇4000；

（4）检测酶：Cas13a蛋白1ng-10μg/反应，T7 RNA聚合酶1~1000U/反应，RNA酶抑制剂1~200U/反应，20 -100mM Tris-HC1 pH7.5，1-10 mM Dithiothreitol(DTT)， 20-50%v/v 甘油，0.01%-1% Triton X-100，0.01-0.5mM EDTA，20-600 mM NaCl；

（5）矿物油：矿物油5-100μL/反应；

（6）质控品：所述阳性质控品为含P. jirovecii-mtLSUrRNA基因检测片段的RNA核酸和人源细胞核酸溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。