[发明专利]一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

说明书

本发明提出了一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法。利用RNA恒温扩增和CRISPR检测技术开发的耶氏肺孢子菌定性检测试剂盒，主要包括：1)扩增缓冲液；2)扩增酶；3)检测缓冲液；4)检测酶；5)矿物油；6)质控品，此技术是对待测样本中核糖核苷酸(RNA)进行扩增检测，具有灵敏度高，特异性强，适用于活菌检测。操作简单，对温控要求低，可降低实验室设备要求，缩短检测时间，易实现自动化操作。为所检测样本的定植、感染状态提供参考，具有重大的临床意义。

技术领域

本发明属于耶氏肺孢子菌检测技术领域，具体涉及一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法。

背景技术

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)，又称为耶氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis jirovecii pneumonia，PJP)，是由耶氏肺孢子菌(Pneumocystisjirovecii)引起，曾经被命名为卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii)，发生于免疫功能受损者，特别是HIV感染者、造血干细胞移植(HCT)和实体器官移植受者、血液系统恶性肿瘤，以及接受糖皮质激素、肿瘤化疗药物和其他免疫抑制药物的患者。其经呼吸道进入人体后，可长期潜伏于气管、支气管或肺泡腔内，形成无症状的隐性感染；当宿主免疫力降低时，处于潜伏状态或新侵入的P.jirovecii开始进行繁殖，产生大量滋养体和包囊，并在肺组织内迅速扩散，引起严重的PCP。

自1984年发现首例艾滋病以来，PCP发病率呈急剧增加的趋势，相关资料表明，该病已是艾滋病患者最主要的并发症和致死原因。另外，随着肿瘤化疗患者、长期接受免疫抑制剂治疗的器官移植受者、自身免疫性疾病患者的增加，非人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的PCP发病率明显增高，病死率高达30％～50％。大概全世界95％的人口在出生后2年内被感染，但健康的成年人是P.jirovecii的无症状携带者。在这些不同的人群中，症状和疾病的严重程度不仅取决于潜在的疾病，还取决于P.jirovecii的负载量，早期发现真菌载量低的携带者和感染的患者至关重要。

目前国内诊断PCP主要依据患者存在的高危感染因素、临床表现、肺部影像学、P.jirovecii病原学结果。其中以呼吸道标本镜检发现特征性包囊、滋养体作为诊断金标准，但由于PCP临床表现缺乏特异性，传统的染色法检测肺孢子菌对检验人员的技术要求较高，而且操作繁琐，以及非HIV感染的PCP患者体内肺孢子菌的负荷量较少，临床阳性诊断率低，制约了PCP病原学诊断率的提高。许多因素会使PCP的诊断变得棘手，例如非特异性症状、其他感染共存以及难以建立该病原体的可靠培养系统等，使得目前的标准临床试验缺乏高灵敏度和灵活性。因此，PCP的准确诊断仍然是一个严峻挑战。

分子诊断技术利用标本中核酸作为检测对象，具有特异性高、灵敏度高、诊断范围广、适应性强而被广泛应用。大量研究指出，荧光定量PCR(qPCR)对微生物检测的灵敏度及阳性预测值都远远高于传统PCR，同时能通过定量方式初步评估菌体定植及感染负荷状态，对确定是否开展抗PCP治疗及制定抗PCP治疗的方案都至关重要。但多数荧光定量检测均是检测P.jirovecii的脱氧核糖核苷(DNA)，而DNA具有双链结构，较稳定，不易降解。治愈后仍有“死菌”残留，人体内完全代谢需2-3周时间，因此在DNA核酸用于分子诊断过程中，易出现“死菌检测为阳性”，不能区分“潜伏感染”和“活动性感染”，易产生交叉污染等，与临床相关性差。相反，RNA呈单链结构，易降解，病原体死亡后2-3天后完全降解，与临床相关性好，有利于疗效评估和及时判愈。有些情况下，可以直接诊断“活动性感染”。并且产物易降解，减少实验室污染风险，维护实验室质控水平。

本专利中一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的方法即利用RNA等温扩增技术，对提取后的靶标RNA进行特异性扩增富集；再通过CRISPR核酸酶特异性识别扩增后的靶标RNA并获得RNA酶活性，切割荧光底物使得荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而产生荧光信号；最后由核酸扩增分析仪读取荧光数值，根据荧光信号强弱对检验结果进行分析判定。

发明内容