[发明专利]同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡及方法

权利要求书

1.一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，包括底板，所述的底板上从左至右依次衔接有吸水纸垫、反应膜、结合垫、样品垫，其特征在于，所述的反应膜上划有氟苯尼考检测线T1、甲氧苄啶检测线T2和质控C线三条线，所述的结合垫上包被有氟苯尼考检测微球、甲氧苄啶检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球；

所述的氟苯尼考检测微球是通过连结有聚乙二醇长链加长臂-dPEG24-的长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球经生物素与链霉亲和素结合制成的；

所述的甲氧苄啶检测微球是通过连结有聚乙二醇长链加长臂-dPEG24-的长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球经生物素与链霉亲和素结合制成的，

所述的氟苯尼考检测微球和甲氧苄啶检测微球制备过程分为三个步骤：

第一步：长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体、长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体的制备方法为：

（1）取出长链生物素NHS-dPEG24-Biotin，室温平衡30min，用DMSO溶解至终浓度10mM备用；

（2）分别取1ml浓度2mg/ml氟苯尼考单克隆抗和1ml浓度2mg/ml甲氧苄啶单克隆抗体至2ml离心管中，每管加入27μl上一步配制的生物素NHS-dPEG24-Biotin，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（3）反应完成后转移至超滤管中，12000g，离心15min，弃废液；

（4）向超滤管中加入2mlPBS缓冲液，12000g，离心15ml，弃废液；

（5）重复步骤（4）5次，200μlPBS复溶，收集标记抗体，BCA试剂盒测浓度；

第二步：链霉亲和素荧光微球的制备方法为：

（1）取1mL标记缓冲液0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；再加入4μl 浓度25mg/ml的NHS和4μl浓度25mg/ml的EDC，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

（2）将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl硼酸盐缓冲液，充分混匀；

（3）取100μg链霉亲和素加入到活化好的微球中，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

（4）每管加入100μl 10%酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min后，离心分离，吸去上清液，留取沉淀；

（5）向上述沉淀加入1mL微球保存液，充分混匀，离心分离，吸去上清液，留取沉淀；

（6）重复步骤（5）2-3次，充分去除未反应的链霉亲和素；再加入1mL微球保存液，充分混匀，备用；

第三步：氟苯尼考检测微球和甲氧苄啶检测微球的制备过程：

（1）分别取长链生物素化氟苯尼考单克隆抗体和长链生物素化甲氧苄啶单克隆抗体各5μg加入2管均含1ml链霉亲和素荧光微球中，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

（2）完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

（3）加入1mL微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

（4）重复步骤（3）3次，充分去除未反应的生物素标记抗体；

（1）加入1mL微球保存液，充分混匀，备用。

2.根据权利要求1所述的一种同步检测禽蛋中氟苯尼考、甲氧苄啶含量的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的反应膜通过下述步骤制得的：

（1）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到0.1mg/mL，作为质控C线工作液；

（2）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将氟苯尼考偶联抗原稀释到0.2mg/mL，作为氟苯尼考检测线工作液；

（3）用含3%蔗糖糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将甲氧苄啶偶联抗原稀释到0.2mg/mL，作为甲氧苄啶检测线工作液；

（4）用喷金划膜仪器在硝酸纤维膜上划氟苯尼考检测线T1、甲氧苄啶检测线T2和质控C线三条线，相邻两线间距5mm，划线浓度均为1μl/cm；划完后置在45℃干燥箱中干燥48小时。