[发明专利]一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法

权利要求书

1.一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，其特征在于：转导干细胞方法的具体步骤为：

S1：以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，然后通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列，且DNA序列包含rs648202单核苷酸，然后对PCR扩增后的产物经限制性内切酶HaeIII进行酶切，同时通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型形成不同长度的DNA片段；

S2：从人体肝细胞中分离出mRNA，并通过反转录-聚合酶链反应技术合成相应的cDNA，将多态分型的DNA片段与内核糖体进入位点(IRES)序列连接形成IRES-klotho片段后再克隆到pBluescript载体中，构建成IRES-klotho重组片段，然后，IRES-klotho重组片段再从pBluescript载体通过XhoI酶切位点转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；

S3：依据LipofectAMINE脂质体转导试剂盒的指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317制备pLXSN-hTERT重组表达载体悬浮液后，在二甲基二氮十一亚甲基聚甲溴化物的辅助下基于pLXSN载体对人体干细胞进行八个小时的pLXSN-hTERT表达载体转导，由此可以构建高效表达外源hTERT基因的人体干细胞；

S4：采用低浓度的潮霉素进行双重筛选转导外源hTERT基因的人体干细胞的技术，提高转导外源hTERT基因的干细胞的存活能力。

2.根据权利要求1所述的一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，其特征在于：S1步骤中核苷酸多肽分型具体为：CC基因型酶切后的DNA片段长度仍为163bp，CT基因型酶切后产生163bp、100bp和63bp三种长度的DNA片段，同时TT基因型酶切后产生100bp和63bp两种长度的DNA片段。

3.根据权利要求1所述的一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，其特征在于：S2步骤中所用的pBluescript载体，人反转录病毒载体是采用pLXIN，能够获得高效表达klotho基因的pfl30表达载体。