[发明专利]一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法

说明书

本发明公布了基因转导干细胞筛选构建方法技术领域的一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列为基础，利用rs648202的T等位位点作为药物设计靶点进行药物的筛选，筛选出能够调节klotho基因表达水平的活性分子，基于人体肝细胞采用多态分型的DNA片段转导，且先后采用hTERT和pLXSN双重载体进行载体转导，达到高效表达hTERT的pLXSN‑hTERT表达载体转导，达到了构建高效表达klotho基因的干细胞的效果，在低溶度潮霉素双重筛选培养体系中，提高转导外源klotho基因的骨髓间充质干细胞的存活能力。

技术领域

本发明涉及基因转导干细胞筛选构建方法技术领域，具体为一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法。

背景技术

原发性肝细胞性肝癌(简称肝癌，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒是一种嗜肝DNA病毒，可引起各种急慢性肝炎、肝硬化等疾病，并与肝细胞癌的发生有非常密切的关系；另外，Klotho是1997年发现与衰老相关的基因，位于人类染色体13q12，长度约为50kb，由5个外显子和4个内含子组成，Klotho基因在小鼠中的表达缺失导致其出现类似于人类衰老的各种表型，近年来，越来越多的研究发现klotho基因可以调节IGF、Wnt、TGF-βl、FGF等信号通路，参与氧化应激过程，并且与机体的免疫缺陷有关，在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥类似抑癌基因的重要作用，因此可以利用klotho来作为肿瘤发生、分级的标志物以及作为靶点用于抗肿瘤的治疗。

目前已有的干细胞体外扩增技术方法大致可归为两类：第一类方法是在培养体系中外加不同组合的重组细胞生长因子，目的是利用细胞生长因子对干细胞增殖和分化进行适当的调控，这类技术方法能在一定程度上提高干细胞的扩增倍数，但如果组合中的细胞因子种类太少，就难以达到理想的扩增效果，而太多的话则会因为费用昂贵而难以在临床移植中应用；第二类是近几年来发展起来的方法，即用骨髓基质干细胞来模拟体内细胞生长和分化的环境，以促进其快速扩增和功能的激活，但在该方法中，由于骨髓基质干细胞中某些细胞因子(如TPO和FL)表达甚微，所以在扩增培养体系中仍需添加外源的细胞因子予以辅助，结合klotho基因在治疗肿瘤方面上的应用，将klotho基因整合人靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型，从而使干细胞获得无限增殖的能力，使之永生，使细胞永生化最常用的技术就是通过构建含端粒酶催化亚基(hTERT)的表达载体，通过各种方法来转染细胞来支持干细胞的体外扩增能力，为此，我们提出一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，转导干细胞方法的具体步骤为：

S1：以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，然后通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列，且DNA序列包含rs648202单核苷酸，然后对PCR扩增后的产物经限制性内切酶HaeIII进行酶切，同时通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型形成不同长度的DNA片段；

S2：从人体肝细胞中分离出mRNA，并通过反转录-聚合酶链反应技术合成相应的cDNA，将多态分型的DNA片段与内核糖体进入位点(IRES)序列连接形成IRES-klotho片段后再克隆到pBluescript载体中，构建成IRES-klotho重组片段，然后，IRES-klotho重组片段再从pBluescript载体通过XhoI酶切位点转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；