[发明专利]二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)多核苷酸，和通过异源DGA1的超量表达增加酵母细胞脂质生产的方法

说明书

本发明涉及二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)多核苷酸，和通过异源DGA1的超量表达增加酵母细胞脂质生产的方法。DGA1催化在酵母中将酰基‑CoA和1,2‑二酰基甘油转化成三酰甘油(TAG)和CoA的最终酶步骤。公开了在产油酵母宿主中表达编码来自圆红冬孢酵母、斯达油脂酵母、裂殖壶菌、土曲霉或麦角菌的DGA1的多核苷酸序列的方法。本文还描述了解脂耶氏酵母的改造的重组宿主细胞，其包含编码DGA1蛋白的异源DGA1多核苷酸或其功能活性部分，具有产生增加的脂质产量的能力并具有提高的葡萄糖消耗效率的特征。

本申请为分案申请，原申请的申请日为2015年2月24日，申请号为201580021065.7(PCT/US2015/017227)，发明名称为“二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)多核苷酸，和通过异源DGA1的超量表达增加酵母细胞脂质生产的方法”。

相关申请

本申请要求2014年2月24号提交的美国临时申请号61/943,664的权益；其内容通过引用由此并入。

发明领域

本发明的领域是产油和/或耐高温酵母的基因工程。编码异源DGA1的多核苷酸在酵母(例如，选自圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、斯达油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)、土曲霉(Aspergillus terreus)或麦角菌(Clavicepspurpurea))中的超量表达导致酵母细胞的改造的菌株，例如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，其能够有效地产生高浓度的脂质。

发明背景

脂质具有多种工业应用，包括在化妆品工业和食品工业中的应用，以及用作生物柴油和各种生物化学品的前体。微生物脂质由许多产油有机体产生，所述产油有机体包括解脂耶氏酵母(Beopoulos A等人，Y.lipolytica as a model for bio-oilproduction.Prog Lipid Res.2009年11月；48(6):375-87)。产油有机体中的脂质产量可通过正调节和/或负调节或删除脂质通道中所涉及的基因来增加(Tai M等人，Engineeringthe push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Y.lipolytica forbiofuel production.Metab Eng.2013年1月；15:1-9；Beopoulos A等人，Control oflipid accumulation in the yeast Y.lipolytica.Appl Environ Microbiol.2008年12月；74(24):7779–7789)。例如，据报道天然解脂耶氏酵母DGA1的正调节显著增加脂质产量和生产率(Tai M等人，Metab Eng.2013年1月；15:1-9)。DGA1(二酰基甘油酰基转移酶)是三酰甘油(TAG)合成的最终步骤中所涉及的脂质通道的关键组分之一，三酰甘油是脂质的主要组分(Beopoulos A等人，Identification and characterization of DGA2,anacyltransferase of the DGAT1 acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase familyin the oleaginous yeast Y.lipolytica.New insights into the storage lipidmetabolism of oleaginous yeasts.Appl Microbiol Biotechnol.2012年2月；93(4):1523-37)。Tai 2013出版物公开了数据，其表明DGA1效率可能是对于产油有机体中的高水平脂质累积而言关键的重要因素。除了同源基因的操纵以外，异源基因也可被引入宿主基因组中并对脂质生产和组成具有显著影响(Courchesne NM等人，Enhancement of lipidproduction using biochemical,genetic and transcription factor engineeringapproaches.J Biotechnol.2009年4月20号141(1-2):31-41)。另外，其它产油酵母，例如圆红冬孢酵母和斯达油脂酵母，能够累积与野生型解脂耶氏酵母菌株相比显著更多的脂质(Sitepu IR等人，Manipulation of culture conditions alters lipid content andfatty acid profiles of a wide variety of known and new oleaginous yeastspecies.Bioresour Technol.2013年9月；144:360-9；Liang MH等人，Advancingoleaginous microorganisms to produce lipid via metabolic engineeringtechnology.Prog Lipid Res.2013年10月；52(4):395-408；Ageitos JM等人，Oily yeastsas oleaginous cell factories.Appl Microbiol Biotechnol.2011年5月；90(4):1219-27；Papanikolaou S等人，Lipids of oleaginous yeasts.Part I:Biochemistry ofsingle cell oil production.European Journal of Lipid Science and Technology2011年6月；113(8):1031-1051；Pan LX等人，Isolation of Oleaginous Yeasts,FoodTechnol.Biotechnol.200947(2):215–220；Ratledge C等人，The biochemistry andmolecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms.Adv ApplMicrobiol.200251:1-51；Kaneko H等人，Lipid composition of 30 species ofyeast.Lipids.1976年12月；11(12):837-44)。尽管尝试通过来自高山被孢霉(Mortierellaalpine)的异源DGA1的超量表达来增加解脂耶氏酵母中的脂质产量，但是未报道对于脂质生产水平有显著影响(美国专利7,198,937)。