[发明专利]检测KISS1基因突变的方法和引物

说明书

本发明公开了检测KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G碱基突变的方法、引物和试剂盒，采用Touch‑down PCR扩增技术和Sanger测序技术，可用于快速检测患者体内KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位点突变情况。利用本发明的试剂盒进行检测的结果准确，对IHH有辅助诊断价值且对恶性肿瘤的转移可能有预测作用。

技术领域

本发明属分子诊断领域，特别涉及KISS1基因突变的检测引物和方法。

背景技术

KISS1基因定位在人类染色体1q32-41，由4个外显子和3个内含子构成。在人正常组织中胎盘表达KISS1最高，其次是睾丸、胰腺、肝脏和小肠等。KISS1及其受体GPR54基因在中枢神经系统和生殖器官中广泛表达，与生殖功能密切相关。KISS1编码的Kisspeptin蛋白可激活促性腺激素释放激素(GnRH)神经元，有力地促进促性腺激素释放激素(GnRH)的释放，调控青春期的启动和生殖。研究发现KISS1/GPR54基因突变的个体会引起特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism,IHH)，该病临床表现为青春期不启动或发育不完全，性激素水平低下而促性腺激素为正常低限或低于正常。

KISS1编码的一个主要的蛋白是转移抑素(Metastin，Kiss肽)，具有抗肿瘤转移的作用。研究发现KISS1的表达水平与多种癌症的转移能力呈负相关关系。研究发现在人黑色素转移瘤及高转移黑色素瘤细胞株中KISS1 mRNA表达缺失非常常见，提示KISS1的缺失与黑色素瘤的进展和转移密切相关。此外，研究者在乳腺癌、肝癌及甲状腺癌中也发现了相类似的表现，在转移程度高的癌症组织中KISS1表达缺失严重。KISS1基因抗肿瘤转移的机制可能与其抑制肿瘤细胞增殖、迁移及克隆形成能力有关，此外也与抑制MMP-9活性有关。

KISS1/GPR54系统在生殖调控中发挥关键作用，可高效促进GnRH的释放，推动青春期的启动，维持哺乳动物的生殖功能。此外KISS1的表达与恶性肿瘤的转移密切相关。检测KISS1基因的基因突变对IHH的早期诊断、早期治疗有辅助作用，且对肿瘤转移可能有预测功能。

发明内容

本发明的目的是提供一个检测KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位点突变的试剂盒，采用Touch-down PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测患者体内KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位点的突变情况。所述检测KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位点突变的引物，其特征在于，包括：扩增KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位点的引物，其碱基序列为：

KISS1-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAGGAAGGAAAAGAAGGATAGGAT

KISS1-R:AACAGCTATGACCATGGCCTCTTGAAATCAGCTAACCA。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

本发明还提供了检测KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位点突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提外周血中的基因组DNA；

(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；

(4)对测序结果进行判断，确定KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位点是否发生突变；