[发明专利]5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用

说明书

本发明提供一种5‑氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)，所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位、第365位、第75位、第29位、第44位的氨基酸残基发生了突变。本发明的ALA合成酶不仅显著提高了活性，同时也部分解除了血红素的反馈抑制。同时，本发明还提供了制备和改造该酶的方法，含有该酶的表达载体、宿主细胞以及该酶在ALA生产中的应用。

本申请是2018年03月08日提交的，申请号为201810191516.7，发明名称为“5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及5-氨基乙酰丙酸合成酶的突变体及其宿主细胞和应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前ALA主要通过化学合成法生产，原料成本和污染物排放量高，导致其生产成本高昂，限制了其在农业、饲料等领域的规模化应用。近年来，通过微生物发酵生产ALA已经得到了产业化应用。ALA的生物合成途径主要有两条，一条是在ALA合成酶的作用下以琥珀酰CoA和甘氨酸为前体合成ALA，称为C4途径，另一条是以谷氨酰tRNA为前体通过两步反应合成ALA，称为C5途径。由于只涉及一步酶促催化反应，目前C4途径被广泛用于ALA高产工程菌株的构建。

ALA合成酶是C4途径合成ALA以及四吡咯化合物的关键酶和限速酶，其酶学性质的好坏直接影响ALA合成的效率。近年来，包括放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter，CN1322132C)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus，CN1974758B)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，CN103146694B)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris，CN103981203B)等大量不同来源的ALA合成酶被克隆鉴定并用于ALA高产菌株的构建。然而，上述ALA合成酶均为不同生物体内天然存在的酶源，本身酶学性质存在热稳定性差(Meng et al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)和受终产物血红素反馈抑制(Zhang et al.Biotechnology Letters,2013,35(5):763-768)等问题，限制了其在工业微生物领域中的应用。嗜热菌来源的ALA合成酶虽然具有较高的热稳定性，但是其比活力或底物亲和力则大幅低于上述常用的ALA合成酶，(Meng etal.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)难以在工程菌中应用。

近年来，随着酶工程和蛋白质工程技术的快速发展，通过理性设计提高酶的催化活性等性质已被广泛应用。但是目前关于在ALA合成酶的理性设计和改造方面的研究并不多，仅有的报道主要涉及真核生物来源的ALA合成酶，Turbeville等将两个小鼠来源的ALA合成酶融合表达后可提高其催化效率(Turbeville et al.Archives of BiochemistryBiophysics,2011,511(1):107-117)，Lendrihas等通过构建小鼠红细胞中ALA合成酶II的突变体库，筛选得到了酶活提高的ALA合成酶突变体(Lendrihas et al.Journal ofBiological Chemistry,2010,285(18):13704)。上述研究虽然获得了酶活提高的ALA合成酶，但并未研究突变酶的热稳定性和抗血红素反馈抑制能力，且没有用于ALA的生物合成。

此外，作为ALA合成过程中的关键酶，ALA合成酶活性、热稳定性和解除血红素反馈抑制等性质的提高可以加快工程菌ALA合成的催化效率，减少自身蛋白合成和降解过程中能量的损耗，进而提升工程菌的稳定性和生产性能，降低ALA生产成本，对促进ALA在农牧等领域的应用有重要的价值。