[发明专利]针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法

说明书

本发明公开了一种针对有转录活性的SARS‑CoV‑2的检测试剂盒和使用方法。所述的试剂盒包含针对有转录活性5UTR‑E基因的crRNA和等温扩增引物，所述的crRNA是由crRNA1、crRNA2或crRNA3中的一种以上组成，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；所述的等温扩增引物是由5’UTR‑E RPA‑F1和5’UTR‑E RPA‑R4组成，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14所示。本发明创造性地筛选到5UTR‑E作为检测靶标，有效区分有活性的SARS‑CoV‑2，可以特异地区分有转录活性SARS‑CoV‑2，而且检测时间可缩短到45min。

技术领域

本发明属于病毒的分子生物学检测领域，具体涉及一种针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法。

背景技术

严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)是COVID-19呼吸系统疾病的病因。SARS-COV-2是一种带包膜的正义单链RNAβ冠状病毒，属于冠状病毒科。针对SARS-CoV-2基因组RNA(gRNA)的核酸检测方法有助于COVID-19的早期诊断和控制。

目前，最常用的诊断方法，包括定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测病毒基因组核酸片段，无法区分样本是来自有复制活性SARS-CoV-2，抑或仅仅是病毒基因组RNA碎片。这种局限性取决于所选取的病毒基因组RNA(gRNA)上的靶标，例如为N基因或ORF1a/b基因。基于RT-qPCR的核酸检测需要专用仪器和训练有素的技术人员，这限制了其现场诊断应用，尤其是在资源有限的地区。因此，需要开发一种能快速检测区分是否有复制活性的SARS-CoV-2的检测方法。

基于CRISPR/Cas的核酸检测技术因其灵敏度高、特异性高、简单、省时等特点而显示出巨大的优势而得到开发利用。CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，Cas12a属于Cas酶第二家族，通过引导RNA指导识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR/Cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。

发明内容

为解决现有技术中缺乏快速准确检测有复制转录活性SARS-CoV-2的方法，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的检测有复制转录活性SARS-CoV-2的试剂盒及使用方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种针对有转录活性5UTR-E基因的crRNA，由crRNA1、crRNA2或crRNA3中的一种以上组成，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；

优选地，所述的crRNA由crRNA1、crRNA2和crRNA3等比例混合而成。

一种针对有转录活性5UTR-E基因的等温扩增引物，由5’UTR-E RPA-F1和5’UTR-ERPA-R4组成，其序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14所示。

一种针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒，包括前述的crRNA和等温扩增引物；

优选地，所述试剂盒还包括ssDNA报告系统和/或Cas12a核酸酶；