[发明专利]一种用于检测农药小分子的整合酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于检测农药小分子的整合酶的制备方法。首先，我们利用表面积大、孔体积大、化学稳定性好、热稳定性好的类沸石咪唑酯骨架制备具有类过氧化物酶活性的多孔碳材料，用于负载同样具备类过氧化物酶活性的亚纳米级的金簇，进而制备纳米复合模拟酶。多孔碳材料和金簇之间的协同催化作用、金簇的小尺寸效应及碳材料纳米孔的限域效应共同增强了纳米复合模拟酶的催化活性。然后，我们将乙酰胆碱酯酶和纳米复合模拟酶进行共价整合，制备成整合酶，提高了乙酰胆碱酯酶的活性和稳定性。与此同时，借助纳米复合模拟酶的高类过氧化物酶活性，利用其与乙酰胆碱脂酶之间的仿生级联催化策略，成功构建了用于检测农药小分子的高效比色传感器。

技术领域

本发明属于材料制备技术领域，尤其涉及一种用于检测农药小分子的整合酶的制备方法。

背景技术

有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂常用来解决农业作物的病虫害问题。然而，农药残留会造成环境污染，威胁人类健康。农药残留检测的传统方法是气质联用色谱，液质联用色谱和毛细管电泳等。但是，这些方法检测周期长、检测成本高。因此，有必要开发一种快速可靠的方法来检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，以进行公共食品安全和环境检测。酶抑制法利用杀虫剂对酶催化活性的抑制作用，可用于快速检测有机磷，氨基甲酸酯类等。目前最广泛使用的酶类为乙酰胆碱酯酶，然而其稳定性不足且价格昂贵，严重限制了其实际应用。最近，有研究报道将乙酰胆碱酯酶固定在电极材料上构建电化学传感器检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂(Electrochim.Acta,2019,318,525-533)。近年来，基于过氧化物酶和游离乙酰胆碱酯酶之间的级联催化反应构建的比色传感器引起了人们的广泛关注。与电化学方法相比，比色法成本低廉，能直观检测分析物(Anal.Chem.,2014,86,514-520)。但是，这种方法仍然存在游离乙酰胆碱酯酶和过氧化物酶不稳定的问题。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种保持游离的乙酰胆碱酯酶活性、提高其稳定性，实现有机磷等农药小分子快检的整合酶的制备方法。

技术方案：本发明的用于检测农药小分子的整合酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成类沸石咪唑酯骨架材料-8；

(2)将类沸石咪唑酯骨架材料-8分散于甲醇水溶液中，调节pH，再加入十六烷基三甲基溴化铵，搅拌反应后，加入正硅酸乙酯，搅拌反应，离心，洗涤，真空干燥得到介孔二氧化硅包覆的沸石咪唑酯骨架材料-8；

(3)将介孔二氧化硅包覆的沸石咪唑酯骨架材料-8置于管式炉中煅烧得到介孔二氧化硅包覆的氮掺杂碳纳米材料；

(4)将介孔二氧化硅包覆的氮掺杂碳纳米材料利用氢氟酸进行刻蚀得到氮掺杂碳纳米材料；

(5)将合成得到的氮掺杂碳纳米材料作为基底，将其分散于溶剂中，超声分散后在剧烈搅拌下加入氯金酸，通过化学试剂或物理法进行还原，反应后过滤、洗涤，真空干燥得到纳米复合模拟酶；

(6)将合成得到的纳米复合模拟酶分散到溶剂中并加入3-巯基丙酸，震荡反应后，离心，洗涤，得到的产物重新分散，并取一定量的分散液向其中加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基，反应后离心，得到的产品分散后，再加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液和乙酰胆碱酯酶制备得到整合酶。

进一步地，步骤(1)中，所述合成类沸石咪唑酯骨架材料-8的方法包括以下步骤：

(a)取摩尔比为1:2～1:10的六水合硝酸锌和2-甲基咪唑，分散在甲醇中搅拌反应1～24h，搅拌速度为搅拌的速度为500～1500rpm；

(b)反应后离心分离，并通过甲醇洗涤3～5次，其中离心分离的转速为5000～13000rpm；

(c)洗涤后的产物在60～120℃下真空干燥24～48h，得到类沸石咪唑酯骨架材料-8。