[发明专利]一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法

说明书

本发明公开了一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC‑MS/MS检测方法，将待测样品禾谷镰刀菌进行前处理制成含有T6P和Tre样品溶液，样品液经色谱柱进行洗脱分离，利用UPLC‑MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量；选取了氨基柱和T3色谱柱适合T6P和Tre两种化合物UPLC‑MS/MS检测，分别建立利用两种色谱柱同时检测禾谷镰刀菌中T6P和Tre的方法，发现氨基柱的灵敏度高，T3色谱柱的回收率高、稳定性好。并利用两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌pH‑1中T6P含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g，Tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g。

技术领域

本发明涉及UPLC-MS/MS检测方法领域，尤其是涉及一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法。

背景技术

禾谷镰刀菌(F.graminearum)是小麦、玉米等农作物中最常见的病原菌，该菌致病，不仅导致农作物产量下降，同时产呕吐毒素，严重影响了农产品的品质和安全性。海藻糖的生物合成途径对真菌的致病力有至关重要的作用，据报道禾谷镰刀菌中敲除海藻糖合成途径相关基因，禾谷镰刀菌将丧失海藻糖合成能力，继而无法产孢，呕吐毒素合成能力下降86％。

T6P，6-磷酸海藻糖是Tre，海藻糖生物合成的中间体，是植物和真菌中必不可少的信号代谢物，对T6P和Tre在禾谷镰刀菌中进行定量，可以为禾谷镰刀菌生长和产毒防控的海藻糖合成途径研究提供支撑。

Tre属于糖类化合物，目前有较为成熟的检测方法。T6P属于酸性强糖，在微生物中含量极低，目前主要采用GC-MS和LC-MS两种方法检测，但是存在以下缺点：GC-MS需要衍生反应，前处理复杂，检测时间长，LC-MS检测时间短，样品前处理简单，但主要采用单级杆质谱扫描，母离子定性定量，假阳性概率较大。此外，由于T6P强酸性质，为强极性难保留和分离的化合物，对色谱柱要求较高，据报道Dionex IonPac AS11-HC column(250×2.0mm,particle size9μm)、SIELC Primesep SB column(4.6×150mm，5μm)、waters Acquity BEHamide column(3.0×100mm,1.7μm)和ZIC-HILIC HPLC column(2.1×150mm,3.5μm)均可用于检测磷酸糖，除waters Acquity BEH amide column可以达到较大的分离度，具有较好的分离效果，其他色谱柱但均存在分离度低、色谱响应值低、色谱柱使用寿命短等问题。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术中所存在的问题，本发明提出了一种具有较好分离度，灵敏度高，回收率高，稳定性好的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法。

技术方案：为达以上目的，本发明采取以下技术方案：

一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行梯度洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量；

所述色谱柱选取Phenomenexluna(100×2mm，3μm)色谱柱或watersAcquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm，1.7μm)色谱柱。

更进一步的，待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下：