[发明专利]一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，将性成熟的斑马鱼按雌雄比1:1.5～2.5的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜取出隔板，待90～150分钟后收集鱼卵，置于含有抑菌素的培养液中，恒温孵育；孵育后将鱼卵随机分为空白对照组和醋酸铅组，空白对照组中加入含有抑菌素的培养液，醋酸铅组中还加入醋酸铅溶液，进行恒温培养；其中，醋酸铅的终浓度为5～20mg/L；培养后的斑马鱼进行软骨染色，与空白对照组相比，若醋酸铅组的染色区域减小，则得到斑马鱼骨质疏松模型。本发明使用操作简便的斑马鱼模型，在醋酸铅溶液处理后可短期快速建立斑马鱼骨质疏松模型。为高速筛选防治骨质疏松的药物及药物机制研究提供简单、高效、高通量的生物模型。

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法。

背景技术

骨质疏松是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一种代谢性骨病。随着我国人口老龄化现象的不断增加，骨质疏松症及其所导致的脆性骨折的发生率也越来越高。目前，骨质疏松动物模型在骨质疏松病因、机制及防治等方面的研究中已经得到广泛的应用。理想的骨质疏松试验动物模型应具有以下特点：(1)方便性：指造模方法简单、模型使用方便；(2)关联性：指模型应最大限度的与人体条件相接近，病变过程、病理改变及转归都应与人类骨质疏松尽可能相似。因此，构建有效的骨质疏松筛药模型，对骨质疏松症的药物治疗和发现安全有效的新药具有重要意义。

目前，用于制备骨质疏松模型的动物主要有大鼠、小鼠、兔和羊等。现有动物骨质疏松模型耗时长，用样量大，活性筛选效率低；现有的细胞模型作用环节单一，成本高，原代培养难度大，一般的实验室不能进行。

斑马鱼是近年来被广泛应用于建立疾病模型和药物发现的重要模式生物，其骨骼形成机制包括软骨内骨化和膜内骨化，其过程受到一系列包括转录因子和激素在内的复杂机制的严格调控，参与调控的关键基因，如osteonectin,osteoprogenin,runx2等与哺乳动物的相关基因具有高度同源性，斑马鱼个体小、易饲养、发育快速、繁殖力强、易于观察和操作，且斑马鱼给药量少，实验耗时短，可进行微孔板形成的高通量筛选。

现阶段，构建斑马鱼骨质疏松模型时主要使用的药物是泼尼松龙或地塞米松，但上述两种药物属于糖皮质激素类药物，在造模时极易因为剂量把握不准而使免疫抑制过强导致斑马鱼胚胎致畸、致死率高。目前还有研究发现，高铁也能够造成斑马鱼骨骼发育缺陷，但高铁诱导的幼鱼骨质疏松模型是否能够用于筛选铁螯合剂以外的其他治疗骨质疏松的药物尚未可知。另外，糖皮质激素和铁是人体内调节生理的必需物质，高浓度的这两种化合物对生物体骨之外的生理影响较大。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明使用操作简便的斑马鱼模型，在醋酸铅溶液处理后可短期快速建立斑马鱼骨质疏松模型。为高速筛选防治骨质疏松的药物及药物机制研究提供简单、高效、高通量的生物模型。

本发明的第一个目的是提供一种斑马鱼骨质疏松模型的构建方法，包括如下步骤：

1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:1.5～2.5的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；培养10～20小时后，取出隔板，待90～150分钟后收集鱼卵；

2)收集到的鱼卵置于含有抑菌素的培养液中，恒温孵育；

3)恒温孵育后将鱼卵随机分为空白对照组和醋酸铅组，空白对照组中加入含有抑菌素的培养液，醋酸铅组中加入含有抑菌素的培养液和醋酸铅溶液，进行恒温培养；其中，醋酸铅组中醋酸铅的终浓度为5～20mg/L；

4)取步骤3)培养后的斑马鱼进行软骨染色，与空白对照组相比，若醋酸铅组的染色区域减小，则得到斑马鱼骨质疏松模型。

进一步地，在步骤3)中，恒温培养的温度为28～29℃。

进一步地，在步骤3)中，恒温培养的时间为8～10天，每天更换培养液。