[发明专利]基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

选取所述lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列；

获取用于所述CRISPRi系统使用的sgRNA核苷酸链Oligo；

切割慢病毒lenti-sgRNA载体，利用T4-DNA连接酶将修改后所述sgRNA序列对应的所述Oligo连接到所述慢病毒sgRNA载体上；

针对标靶细胞系，利用慢病毒包装试剂盒包装所述慢病毒sgRNA载体及crspr-dcase9载体，分别制备红色荧光lenti-dcase9-mcherry慢病毒以及蓝色荧光lenti-sgRNA-BFP慢病毒；

所述lenti-dcase9-mcherry慢病毒和所述lenti-sgRNA-BFP慢病毒转染所述标靶细胞系，分选红色荧光蛋白mcherry、蓝色荧光蛋白BFP双重阳性细胞；

筛选转染后的标靶细胞以获得稳定转染慢病毒sgRNA及dcase9载体的单克隆标靶细胞系。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述选取所述lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列的步骤之前，所述方法还包括：

获取目标细胞核内长链非编码lncRNA全长DNA序列。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述切割慢病毒sgRNA载体，利用T4-DNA连接酶将修改后所述sgRNA序列对应的所述Ol igo连接到所述慢病毒sgRNA载体上的步骤之前，所述方法包括：

根据所使用的慢病毒sgRNA载体修改所述sgRNA 5’端及3’端序列。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述SgRNA的Ol igo是根据以下sgRNA核心序列片段以及所连接载体修饰后所得的：

sgRNA核心序列1:GAAACCGAAGGCCCGAGCGGAGG；

sgRNA核心序列2:CCAGCCGGCCTGCGCACCGGCGG；

sgRNA核心序列3:CTGGGGACTCGCCTCCGCTCGGG；

sgRNA核心序列4:GCCGGTGCGCAGGCCGGCTGGGG；

sgRNA核心序列5:GCTGGGGACTCGCCTCCGCTCGG；

sgRNA核心序列6:GCCGGCCTGCGCACCGGCGGCGG。

5.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述设计CRISPRi系统使用的向导sgRNA序列的步骤具体包括：

使用网络sgRNA预测数据库平台设计长度为20bp的所述sgRNA序列。

6.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述慢病毒包装试剂盒是lipo2000转染试剂盒、lipo3000转染试剂盒、磷酸钙转染试剂盒的其中一种。

7.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述慢病毒lenti-sgRNA载体是慢病毒sgRNA表达载体是Addgene 60955、Addgene 118650、Addgene65656的其中一种。

8.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，其特征在于，所述筛选转染后的单克隆细胞获得稳定转染CRISPR-dcase9及sgRNA的所述标靶细胞系具体为：

利用96孔板筛选转染后的单克隆细胞获得稳定转染CRISPR-dcase9及sgRNA的所述标靶细胞系。