[发明专利]基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，该方法包括：选取lncRNA转录起始位点上下游100bp序列范围用于设计向导sgRNA序列；获取用于系统使用的Oligo；切割慢病毒载体，利用连接酶将修改后sgRNA序列对应的Oligo连接到慢病毒载体上；针对标靶细胞系，利用慢病毒包装试剂盒包装慢病毒及dcase9载体，分别制备红色荧光慢病毒以及蓝色荧光慢病毒并转染标靶细胞系，分选双重阳性细胞；筛选获得稳定转染慢病毒及dcase9载体的单克隆标靶细胞系。本发明旨在解决现有的基因敲减技术无法稳定敲减核内lncRNA的技术问题。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法。

背景技术

长链非编码IncRNA(long non-coding RNA)是一类长度超过200nt的RNA分子，位于细胞核或胞质内；其只转录不翻译的RNA分子，其参与细胞分化、凋亡、免疫应答、生长发育、糖脂代谢、炎症以及肿瘤等多种生命过程。长链非编码RNA按照其来源可分为AntisenselncRNA(反义长非编码RNA)，Intronic tran(内含子非编码RNA)，Long intergencnoncoding RNA(lincRNA)，Promoter-associated lncRNA(启动子相关lncRNA)，UTRassociated lncRNA(非翻译区lncRNA)五种类型。lncRNA在转录前、转录水平与转录后水平上均具有重要作用。在整个基因组转录产物中，lncRNA所占的比例远远超过编码RNA所占的比例，与人类和动物相比，植物lncRNA研究仍处于起步阶段，植物lncRNA的研究可能揭示控制植物生长和分化的未知新机制，lncRNA在植物开花、雄性不育、营养代谢、生物和非生物胁迫等多种生物过程中起着调节因子的作用。核内lncRNA(HoxBlinc)具有调控白血病发生发展过程中重要的转录因子HoxB系列基因的功能。

研究长链非编码LncRNA常规操作是功能获得(过表达)以及功能缺失(干扰或敲除)，RNAi技术是常用的敲减手段，RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。但是现有的基因敲减技术无法稳定敲减主要位于核内的lncRNA，具体的，shRNA(短发夹RNA)主要作用位点在于细胞质，针对主要位于细胞核内的lncRNA敲减存在不稳定性，往往造成后续实验多次重复的不稳定性，同时针对shRNA的设计显的尤其重要并且具有很高的不确定性，这往往导致实验资源的浪费，并且造成实验结果的不稳定性，以及难重复性。另外，ASO(反义寡核苷酸)跟siRNA(小干扰RNA)设计原理类似，只是化学成分上有区别，siRNA是反义RNA，而ASO则是反义RNA、DNA的杂合物，胞浆定位的lncRNA由RNA-RNA形成的二元复合物以RISC的形式被Dicer酶降解，而核定位lncRNA则形成DNA-RNA复合物被RNAse H分解(核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA)。ASO是多能选手，但是化学合成的ASO只适合常规的细胞学实验，只能瞬时转染的特性导致其不能构建稳定转染细胞株以进行长期研究，更不适合动物水平的基因功能研究。

发明内容

本发明的主要目的在于提出一种基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法，旨在解决现有的基因敲减技术无法稳定敲减主要位于核内的lncRNA的技术问题。

CRISPRi系统是在DNA水平实现基因的转录抑制，dCas9(失去切割活性的cas9)与转录抑制域KRAB融合，表达的融合蛋白在gRNA介导下结合到启动子区，并通过KRAB蛋白抑制真核生物启动子PolII与启动子的结合，从而抑制基因的转录。CRISPRi是在转录前发挥作用，所以不必考虑lncRNA本身的特质，CRISPRi系统可以在细胞系里稳定表达，同时弥补了RNAi以及ASO技术的缺点。