[发明专利]一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)PCR扩增CYP5061基因左右同源臂，分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后回收，将回收得到的CYP5061基因左右同源臂分别插入pPZP中，得到重组质粒；

所述CYP5061基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述CYP5061基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

克隆CYP5061基因的左臂时，利用SacⅠ和KpnⅠ将CYP5061基因左臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；

克隆CYP5061基因的右臂时，利用XbaⅠ和HindⅢ将CYP5061基因右臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；

所述CYP5061基因的左臂在pPZP中的插入位点为SacⅠ和KpnⅠ，所述CYP5061基因的右臂在pPZP中的插入位点为XbaⅠ和HindⅢ；

(2)将重组质粒电转化至根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；

(3)将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养，得到重组黑曲霉。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，扩增CYP5061基因的左同源臂时，所用的引物对包括CYP5061-L-F和CYP5061-L-R；所述CYP5061-L-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CYP5061-L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

扩增CYP5061基因的右同源臂时，所用的引物对包括CYP5061-R-F和CYP5061-R-R；所述所述CYP5061-R-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述CYP5061-R-R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循坏；72℃延伸10min。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，扩增CYP5061基因的左同源臂时，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，包括DNA模板2μL、CYP5061-L-F2μL、CYP5061-L-R 2μL、10×Pyrobest BufferⅡ5μL、Pyrobest DNA Polymerase 0.5μL和余量的ddH₂O；

扩增CYP5061基因的右同源臂时，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，包括DNA模板2μL、CYP5061-R-F 2μL、CYP5061-R-R 2μL、10×Pyrobest BufferⅡ5μL、Pyrobest DNAPolymerase 0.5μL和余量的ddH₂O。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述CYP5061-L-F、CYP5061-L-R、CYP5061-R-F和CYP5061-R-R的工作浓度均为10μmol/L。

6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述根癌农杆菌优选为根癌农杆菌AGL-1。

7.利用权利要求1～6任一项所述构建方法构建得到的重组菌在表达甾体C16β羟化酶和表达甾体C16β-OH-4-AD中的应用。

8.一种制备C16β-OH-4-AD的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用权利要求1～6任一项所述构建方法构建得到的重组菌发酵转化底物4-AD从发酵液中萃取产物C16β-OH-4-AD。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为28℃，时间为48h。