[发明专利]一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用，特别涉及基因工程领域。本发明提供了一种高效表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：PCR扩增CYP5061基因左右同源臂，分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后回收，将回收得到的CYP5061基因左右同源臂分别插入pPZP中，得到重组质粒；将重组质粒电转化至根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养，得到重组黑曲霉。敲除本发明所述基因得到的菌株转化4‑AD生成16β‑OH‑4AD特异性明显提高。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用。

背景技术

甾体激素类药物对机体起重要调节作用，是临床上必不可少的药物，广泛用于消炎、避孕、治疗心血管疾病、抗肿瘤、人体器官移植、内分泌失调和老年性疾病等。甾体激素类药物主要分为三大类：1)肾上腺皮质激素，如去氧皮质酮、氢化可的松、可的松等，主要用于免疫抑制、抗炎和抗毒素；2)性激素，包括雌激素、孕激素和雄激素三类，主要用于治疗性功能型疾病和避孕等；3)蛋白同化激素，是一种半合成激素类药物，主要通过改造天然来源的雄激素结构，是其激素活性降低，蛋白同化活性提高。如南诺龙、康力龙等，主要用于治疗骨质疏松、血管疾病和发育疾病等。

雄甾-4-烯-3，17-二酮简称雄烯二酮(4-AD)，是生产甾体激素类药物的关键中间体。4-AD在体内可作为雄激素和雌激素的前体，通过代谢生成雌雄激素来维持机体正常运转。同时4-AD可作为起始原料合成几乎可以生产所有肾上腺皮质激素、性激素及蛋白同化激素等甾体激素类药物，如用于治疗心血管疾病的坎利酮、普利酮等都可以通过4-AD生产。

甾体微生物转化是利用微生物代谢产生的酶对甾体底物的特定部位进行的化学结构修饰的反应。微生物转化甾体具有化学合成所没有的区域选择性和立体选择性，被广泛应用于甾体类药物及其关键中间体的生产。在甾体微生物羟化反应中，11α、11β、15α、16α因其能产皮质甾类化合物类似物而应用广泛。但16β羟基化的相关报导仍然较少。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用。敲除所述基因后所得菌株能够高效转化4-AD，且特异性明显提高。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种高效表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增CYP5061基因左右同源臂，分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后回收，将回收得到的CYP5061基因左右同源臂分别插入pPZP中，得到重组质粒；

所述CYP5061基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述CYP5061基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

克隆CYP5061基因的左臂时，利用SacⅠ和KpnⅠ将CYP5061基因左臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；

克隆CYP5061基因的右臂时，利用XbaⅠ和HindⅢ将CYP5061基因右臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；

所述CYP5061基因的左臂在pPZP中的插入位点为SacⅠ和KpnⅠ，所述CYP5061基因的右臂在pPZP中的插入位点为XbaⅠ和HindⅢ；

(2)将重组质粒电转化至根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；

(3)将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养，得到重组黑曲霉。