[发明专利]一种用于鲟鱼种质鉴定的SNP引物和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于鲟鱼种质鉴定的SNP引物和检测方法。本发明通过比对施氏鲟、西伯利亚鲟、达氏鳇线粒体基因组开发种质特异性SNP位点，发明外围引物2对，中间引物7条，能够对施氏鲟、西伯利亚鲟、达氏鳇进行种质鉴定，应用于鲟鱼种质资源鉴定。本发明中的SNP引物适用于SNaPshot检测技术，兼具了高效准确及低成本的特点，不只可以准确的检测突变位点，也可以实现高通量的检测需求。

技术领域

本发明属于鲟鱼鉴定技术领域，特别是涉及一种用于鲟鱼种质鉴定的SNP引物和检测方法。

背景技术

鲟鱼是现存起源最早的脊椎动物之一。鲟鱼隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、软骨硬鳞总目、鲟形目。大家通常所说的鲟鱼就是指鲟形目的鱼类。鲟形目鱼类是一类多倍体起源的鱼类，染色体数量多，存在多种天然杂交种，鲟科鱼类的杂交种具有高的能育性的生物学特性。鲟鱼，特别是杂交鲟，很难从形态学上进行区分，且形态学主观性强，易造成错判。鱼类种质分子鉴定技术是利用分子生物学技术发展起来的以研究生物种类鉴定和系统进化关系为目的的新技术，通过鉴定DNA水平上的差异来鉴别品种。单核苷酸多态性是基因组DNA序列中某个特定位点的单个核苷酸发生变异而引起的序列多态性。SNP遍布整个基因组，人类平均1900bp就有一个SNP，与微卫星相比，它具有更高的遗传稳定性，并且可以实现检测自动化，非常适合用于种质鉴定的高速量检测。测序是公认的最为准确的基因分型技术，是最为直观、高效、无污染的突变检测技术，但费用较高。本研究采用的SNaPshot检测技术又称为微测序，兼具了高效准确及低成本的特点，不只可以准确的检测突变位点，也可以实现高通量的检测需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鲟鱼种质鉴定的SNP引物和检测方法，解决了现有的问题：针对鲟种质鉴定中技术的不足，提供一种直观、准确、高效的用于西伯利亚鲟、施氏鲟、达氏鳇的种质鉴定方法。并提供上述SNP引物鉴定鲟鱼种质的应用。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种用于鲟鱼种质鉴定的SNP引物和检测方法，采用AF+AR+SNP1/SNP2/SNP3/SNP4或BF+BR+SNP5/SNP6/SNP7的引物组合可以用于鉴定鲟鱼的种质。检测方法包括样品采集和DNA提取、引物扩增SNP位点和SNaPshot检测SNP位点，所述样品采集和基因组DNA提取包括以下步骤：

步骤一：采集待测鲟鱼尾鳍样本；

步骤二：将尾鳍样本固定于无水乙醇中，4℃保存备用。

进一步地，一种用于鲟鱼种质鉴定的SNP引物,由2对外围引物和7个中间引物组，各引物的核苷酸序列如下表所示：

进一步地，所述SNaPshot检测SNP位点包括以下步骤：

步骤一：外围引物扩增目的片段条件：PCR反应总体积为50μL，其中：模板DNA100ng，I-5^TM High-Fidelity Master Mix(MCLAB)25μL，外围引物(10μmol/L)各2μL，补充无菌双蒸水至50μL；

步骤二：外围引物扩增目的片段程序：98℃2min；98℃10s，57℃10s，72℃10s，30个循环；72℃延伸5min。

步骤三：PCR产物用SAP酶消化去除PCR体系中剩余的dNTP和引物，反应条件：37℃1h，75℃15min，4℃∞；

步骤四：中间引物扩增SNP位点，单链延伸：

反应体系：5μL

SAP消化后Template              2μL

ABI SnapShot multiplex Mix     2μL