[发明专利]一种高纯度NK细胞的分离培养方法

权利要求书

1.NK细胞三阶段使用的培养基组合，其特征在于，

所述培养基组合包含培养基1、培养基2和培养基3，所述培养基2和培养基3不含IL-15,所述培养基1在NK细胞生长的前两天使用，所述培养基2在NK细胞生长的第3-5天和第8-14天使用，所述培养基3在NK细胞生长的第6天使用；

所述培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2、终浓度为30μg/mL的IL-15和终浓度为10％的自体血浆组成；

所述培养基2为终浓度为500U/mL的IL-2组成；

所述培养基3为终浓度为500U/mL的IL-2和终浓度为5％的自体血浆组成。

2.含有权利要求1所述的培养基组合的NK细胞的体系，其特征在于，所述NK细胞为经过RosetteSep^TM Enrichment Cocktail法初步分离纯化而得的纯化NK细胞。

3.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述纯化NK细胞的CD3-CD56+NK细胞比率达到88.3％。

4.根据权利要求2所述的体系，其特征在于，所述纯化NK细胞与所述培养基1共存2天，得活化NK细胞。

5.根据权利要求4所述的体系，其特征在于，用培养基2替换培养基1，让所述活化NK细胞与所述培养基2在第3-5天共存，得扩增NK细胞。

6.根据权利要求5所述的体系，其特征在于，用培养基3替换培养基2，让所述扩增NK细胞与所述培养基3在第6-8天共存，第8天至第14天，每间隔2天加入培养基2，培养至第14天，得对数生长期的NK细胞。

7.降低或排除T细胞和/或Treg细胞和/或B细胞污染的NK细胞培养方法，其特征在于，利用权利要求1所述的培养基组合进行培养，具体步骤包括：

(1)采血，利用RosetteSep Enrichment Cocktail富集NK细胞，Herceptin包被培养瓶；

(2)步骤(1)中NK细胞加入所述培养基1孵育，转入已包被抗体的培养瓶，在第1-2天共存，得到活化NK细胞；

(3)第3天，用培养基2替换培养基1，让所述活化NK细胞与培养基2在第3-5天存在，得扩增NK细胞；

(4)第6天，用培养基3替换培养基2，后续每隔2天，加入培养基2，在第14天后得到降低或排除T细胞和/或Treg细胞和/或B细胞污染的NK细胞。

8.权利要求7所述NK细胞培养方法培养得到的降低或排除T细胞和/或Treg细胞和/或B细胞污染的NK细胞。

9.权利要求8所述的降低或排除T细胞和/或Treg细胞和/或B细胞污染的NK细胞在制备同种异体回输剂中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述同种异体回输剂需满足临床使用需要，所述降低或排除T细胞和/或Treg细胞和/或B细胞污染的NK细胞为扩增200-1000倍的细胞，所述细胞数量为3-8×10⁹。