[发明专利]一种高纯度NK细胞的分离培养方法

说明书

本发明提供了一种用于分离培养高纯度NK细胞的试剂盒，它包含培养基1‑3，本发明还提供了一种高纯度NK细胞的分离培养方法。利用本发明提供的试剂盒及分离培养方法，可以高效获得满足临床使用的NK细胞，细胞数量多，纯度高、杀伤活性好，在同种异体NK回输方面具有突出优势，应用前景良好。

本发明为申请日：2017年9月5日，申请号：201710791174.8，专利名称：一种高纯度NK细胞的分离培养方法的分案。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种高纯度NK细胞的分离培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来，NK细胞因其细胞杀伤活性高，起效快，且不受MHC限制等优点，相对于αβT细胞，γδT细胞和CIK等其它用于免疫治疗的细胞NK细胞受到了更广泛的关注和临床应用。

但是NK细胞数量较少，在外周血中仅占淋巴细胞的10％-15％，在脐带血中NK的含量更低，只有5％左右，正常人体外周血中和脐带血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。NK细胞的数量和纯度是临床疗效的重要影响因素，NK细胞数量太少不能达到治疗的效果，纯度低则会影响对肿瘤的杀伤作用。尤其是临床上多采用健康供者的血液来制备NK，然后采用同种异体回输以达到治疗目的，这就对所回输NK细胞的纯度要求比较高，如果其中混入过多T细胞B细胞等杂细胞则会引起机体的排斥反应。因此，如何分离制备得到高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用中亟待解决的问题。

目前，国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和生物治疗方面的研究，但培养得到的NK细胞存在数量较少、或纯度较低、或杀伤活性低等问题，不能满足实际应用的需要。例如：公开号为CN 102268405A的专利申请，报道了一种NK细胞体外活化扩增培养的方法，其培养过程中不仅需要添加饲养细胞，虽然可在体外大量扩增NK细胞，但是安全性问题和回输到体内后并无饲养层细胞，体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响是其无法回避的问题。

公开号为CN 104928242 A的专利申请报道了一种NK细胞的培养方法，培养15天后，NK细胞仅扩增139.5倍，数量仍较少，而且杀伤活性较低。

公开号为CN 103627672A的专利申请报道的NK细胞体外培养方法，得到的培养产物中，NK细胞仅扩增102.81±94.06倍，而且采用传统的Ficoll法密度梯度离心法分离NK细胞，数量和纯度不佳。

因此，急需对NK细胞的制备方法进一步改进，以制备高产量、高纯度、杀伤活性好的NK细胞。

发明内容

本发明旨在克服现有外周血/脐带血NK细胞体外分离、纯化、扩增方法的不足，提供一种高产量、高纯度NK细胞的分离培养方法。

本发明提供了一种用于分离培养高纯度NK细胞的试剂盒，它包含培养基1-3；其中，

培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2、终浓度为30-50μg/mL的IL-15和终浓度为5-10％的添加物组成；

培养基2是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2组成；

培养基3是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2和终浓度为5-10％的添加物组成；

其中，所述无血清培养基为淋巴细胞培养用无血清培养基；所述添加物为：自体血浆、胎牛血清或市售血清替代物。

淋巴细胞培养用无血清培养基：即适合淋巴细胞生长的无血清培养基。