[发明专利]一种重组a-L-艾杜糖醛酸普酶及其制备方法

权利要求书

1.分离的核苷酸序列，其特征在于，包括信号肽序列和编码a-L-艾杜糖醛酸普酶核苷酸序列，其中，信号肽序列不是a-L-艾杜糖醛酸普酶的天然信号肽序列。

2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述信号肽选自如SEQ ID No:1、SEQID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示的序列。

3.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述编码a-L-艾杜糖醛酸普酶核苷酸序列如SEQ ID No:9所示。

4.分离的核苷酸序列，选自下列序列：

1)SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7或SEQ ID No:8；

2)与SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7或SEQ ID No:8具有至少80％以上同源性的核苷酸序列；

3)编码多肽的密码子与1)或2)中的核苷酸序列的编码部分简并、且编码的是a-L-艾杜糖醛酸普酶的核苷酸序列。

5.一种重组a-L-艾杜糖醛酸普酶，其包括a-L-艾杜糖醛酸普酶和异源信号肽，所述异源信号肽能在单一位点被切割。

6.一种重组a-L-艾杜糖醛酸普酶，其氨基酸序列选自下列序列：

1)SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12或SEQ ID No:13；

2)与SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12或SEQ ID No:13具有至少95％以上同源性的氨基酸序列。

7.如权利要求5所述的重组a-L-艾杜糖醛酸普酶，其特征在于，在第311位、390位和426位具有糖基化修饰。

8.如权利要求6所述的重组a-L-艾杜糖醛酸普酶，其特征在于，所述糖基化修饰为GlcNAc(2)Man(7)P(2)。

9.如权利要求5所述的重组a-L-艾杜糖醛酸普酶，其特征在于，所述重组a-L-艾杜糖醛酸普酶的细胞内化是由M6PR介导的。

10.一种重组a-L-艾杜糖醛酸普酶的制备方法，其特征在于，使用如权利要求1-4中任一项所述的分离的核苷酸序列进行真核表达，或真核表达如权利要求5-9中任一项所述的重组a-L-艾杜糖醛酸普酶。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在分离的核苷酸序列前加上KOZARK序列，构建至真核表达载体上，然后转入真核表达系统中进行表达。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述KOZARK序列为GCCGCCACCATGC。

13.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达为在哺乳动物细胞中进行表达。

14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHOK1SV GS-KO。

15.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，包括：构建含有所述分离的核苷酸序列的重组真核表达载体；将所述重组真核表达质粒转入真核表达系统中，进行真核表达；收集上清，进行纯化后获得a-L-艾杜糖醛酸普酶。

16.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括亲和层析、疏水相互作用层析以及离子交换层析中的一种或多种。

17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析为使用琼脂糖凝胶进行线性梯度洗脱，获得含有目的蛋白的洗脱液。