[发明专利]一种重组a-L-艾杜糖醛酸普酶及其制备方法

说明书

本发明公开了分离的核苷酸序列，包括信号肽序列和编码a‑L‑艾杜糖醛酸普酶核苷酸序列，其中，信号肽序列不是a‑L‑艾杜糖醛酸普酶的天然信号肽序列。通过使用人工信号肽替换天然信号肽，能提高a‑L‑艾杜糖醛酸普酶的表达量，还能产生切点单一，且翻译后修饰(N‑糖基化磷酸化)正确的蛋白，能跨越细胞膜，在细胞内发挥酶活性。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种重组a-L-艾杜糖醛酸普酶及其制备方法。

背景技术

黏多糖贮积症(MPS)，是一种罕见病，其主要是因为溶酶体中降解黏多糖所需要的水解酶的缺陷，导致组织内大量的黏多糖贮积。黏多糖病Ⅰ型(MPS I)，是由于a-L-艾杜糖醛酸普酶(Alpha-L-Iduronidase)缺乏导致的代谢紊乱综合征，其症状最重的亚型又称Hurler综合征，常在10岁左右死亡，临床可见智能低下、面容丑陋、肝脾肿大、骨骼病变、心血管病变、角膜混浊和耳聋等多种表现。目前除了对症处理外，还有骨髓移植和基因治疗，但治疗过程复杂，风险性高，治疗效果不确切。临床上的重组酶替代疗法，是目前唯一疗效确实的药物疗法，通过静脉注射，风险小，但需要终身治疗，且费用高昂。

Aldurazyme是Genzyme和BioMarin公司共同研制的重组的Alpha-L-Iduronidase，用于MPS-I的酶替代治疗，也是目前唯一一种市售的治疗MPS I的特异性药物。

a-L-艾杜糖醛酸普酶存在于哺乳细胞胞浆中的溶酶体，正常人血清中检测不到。其氨基酸序列中有一段不典型的信号肽序列(1-27：MRPLRPRAALLALLASLL AAPPVAPAE)[Uniprot https://www.uniprot.org/uniprot/P35475]，然而，信号肽预测软件[SignalP]分析显示，其信号肽的切割位置至少有三处[图10]，而且信号肽切割位置并不在27-28位氨基酸处。因此，a-L-艾杜糖醛酸普酶的信号肽引导的分泌过程，并不是经典的蛋白质翻译后从内质网到细胞外的分泌过程，可能主要是引导翻译后的蛋白质从内质网到溶酶体的过程。从20世纪90年代起，人们就试图从不同组织中提取天然的酶，发现不同组织来源的酶的氨基端有很大差别[Clements et al.,1989]。这一发现也间接证实了a-L-艾杜糖醛酸普酶的所谓的‘分泌性信号肽’并不是典型的分泌性蛋白的信号肽。尽管如此，1968年Neufeld发现a-L-艾杜糖醛酸普酶仍然可以从细胞中分泌出来并被周围基因缺陷的细胞摄取，缓解胞浆内黏多糖贮积的表型[Fratantoni et al.,1968]，这一发现成为后来推动利用基因工程生产a-L-艾杜糖醛酸普酶，并用于临床治疗的奠基性发现。

进一步的研究显示，a-L-艾杜糖醛酸普酶上有多种翻译后的修饰，除了常见的N-糖基化外，还有两处甘露糖糖基的磷酸化(bisphsophorylated oligomannosidicglycan)。其中347位氨基酸的糖基化是底物识别所必须的[Maita et al.,2013]，311和390位氨基酸的甘露糖糖基磷酸化是结合6-磷酸-甘露糖受体(Mannose-6-phosphatereceptor，M6PR)，并实现细胞内化的关键修饰，通过M6PR跨越细胞膜，从细胞外进入细胞浆，然后再通过M6PR进入溶酶体。因此翻译后的修饰被认为是a-L-艾杜糖醛酸普酶发挥正常活性不可或缺的。由于这些特殊的翻译后修饰(N-糖基化磷酸化)形成的过程仍然不清楚，猜测可能是在分泌过程中形成的。

基于a-L-艾杜糖醛酸普酶复杂的翻译后修饰(N-糖基化磷酸化)，第一代重组酶(Aldurazyme)谨慎地利用了其自身天然的信号肽，并通过DNA重组技术，在CHO细胞中，10％FBS的培养基条件下进行生产，从培养上清中获取得到。但其产量低，约为20-40μg/天/10E7细胞。低表达量给后续的纯化带来很多挑战；尤其是如果利用a-L-艾杜糖醛酸普酶的天然信号肽，可能会导致不一致的氨基端，极大地限制了重组酶的纯度和均一性。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能提高a-L-艾杜糖醛酸普酶表达量的重组a-L-艾杜糖醛酸普酶及其制备方法。

发明内容