[发明专利]一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用

说明书

本发明公开了一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用，属于基因工程领域。本发明所述的表达系统时基于硝酸盐还原酶启动子受硝酸盐诱导铵盐抑制的特性。在此基础上表征了其自诱导的特征。各实验结果充分说明基于硝酸盐还原酶启动子的自诱导构巢曲霉表达系统能够进行自诱导表达，丰富了构巢曲霉的表达系统形式，培养方式操作简单，在构建蛋白表达系统方面有巨大的应用空间。

技术领域

本发明涉及一种构巢曲霉自诱导型表达系统及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

目前微生物表达系统主要有细菌，酵母，丝状真菌表达系统。细菌表达系统具有生长快，背景清晰等优势，但是，细菌中不存在翻译后修饰系统，表达真核来源的蛋白容易产生无活性的包涵体；酵母表达系统是一种真核表达系统，有翻译后修饰系统，但是不完善，容易发生过度糖基化；丝状真菌表达系统具有完善蛋白质修饰系统，其更接近高等生物。

构巢曲霉作为一种丝状真菌模式菌株，主要有两种表达方式，组成型和诱导型表达，经常使用组成型强启动子P_gpdA，乙醇诱导型启动子P_alcA进行异源蛋白的表达。由于构巢曲霉属于食品安全菌株，其作为一种重要的目的蛋白表达系统，在工业生产中得到广泛应用。

但是，目前在构建构巢曲霉表达系统进行目的基因的表达时，往往需要通过更换培养基或者其他方式，在菌株的生长过程中额外的添加诱导剂或者其他生长因子，导致该表达系统无法实现自诱导，在工业生产中的应用受阻。

例如公开于Resistance Gene-Guided Genome Mining:Serial PromoterExchanges in Aspergillus nidulans Reveal the Biosynthetic Pathway forFellutamide B,a Proteasome Inhibitor和An Efficient System for HeterologousExpression of Secondary Metabolite Genes in Aspergillus nidulan文章中的采用构巢曲霉表达系统诱导生产次级代谢物时，都是直接进行诱导表达，而未实现自诱导表达。

又如，公开号为CN108795970A的中国发明专利申请文件中，采用其构建的构巢曲霉表达系统进行漆酶的生产时，培养周期为4天，并且在培养48小时后需要添加终浓度为0.2-0.5mM的CuSO₄进行诱导；可见目前所构建的构巢曲霉表达系统不仅周期长，在生产过程中，需要额外的添加诱导剂，这使得生产工艺复杂，增加了生产成本，不利于大规模的工业应用。

近年来，自诱导表达模式的研究已经在细菌表达体系中展开。利用甘露糖操纵子上的启动子构建了前期受葡萄糖抑制后期受甘露糖诱导的高密度自诱导表达系统，提高了蛋白的表达量。这为我们在构建智能型构巢曲霉表达系统提供了思路。

虽然构巢曲霉培养简单，生长快，基因操作方法容易，具有完善的蛋白质修饰系统。但是，与细菌和酵母表达系统相比，曲霉表达系统研究起步较晚，还存在很大的差距。例如，曲霉表达系统中存在可选择的表达载体较少，表达模式单一，质粒不能稳定遗传等缺陷，无法满足更高的蛋白表达的需求。因此，开发一种低培养成本，操作简单的新型构巢曲霉自诱导表达体系是非常必要的。

发明内容

技术问题

本发明要解决的技术问题是：构建一种无需在培养中间阶段额外添加诱导剂或更换培养基，即可实现目的基因的表达的自诱导型构巢曲霉表达系统，即：构建一种生产周期短、生产成本低并且生产工艺简单的构巢曲霉表达系统，以实现构巢曲霉在工业上大规模的应用。

技术方案