[发明专利]快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法

权利要求书

1.一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、先将中性粒细胞分离液加入分离管，再将人体全血加至中性粒细胞分离液的上方并形成全血层；

第二步、将分离管进行离心，使管内液体分为5层，各层从上至下依次为血浆层、细胞分离液层、单核细胞层、中性粒细胞层、红细胞层，其中血浆层为顶层，红细胞层为底层；先弃去血浆层、细胞分离液层以及单核细胞层，再将中性粒细胞层、以及由中性粒细胞层向红细胞层过渡的液体收集至洁净的分离管中，并弃去作为底层的红细胞层；

第三步、将第二步所得液体进行稀释、离心后，弃去上清，获得细胞团块；加入红细胞裂解液并悬浮细胞，置于冰上进行裂解；之后，离心弃去上清，重悬细胞；

第四步、采用中性粒细胞磁珠分选试剂盒，取试剂盒中的抗体并加至第三步所得重悬细胞中，颠倒混匀；加入磁珠并颠倒混匀；将分离管插入磁铁架中静置；静置后，将分离管中含细胞的缓冲液转移至洁净的分离管，即得超高纯度人体血液中性粒细胞。

2.根据权利要求1所述快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，在第一步之前，将所有试剂静置于室温下，待各试剂温度稳定后再从第一步开始进行分离；所述室温指环境温度。

3.根据权利要求1所述快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，第一步中，所述中性粒细胞分离液与人体全血的体积比为1±0.1：1；第二步中，离心条件为500±10g/min离心20-30min，且离心刹车设置为0。

4.根据权利要求3所述快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，第三步中，采用不含钙镁的HBSS缓冲液进行稀释，该HBSS缓冲液与人体全血的体积比为2±0.1：1，颠倒混匀数次使细胞悬浮；稀释后的离心条件为350±5g/min的速度离心10-15min；所述红细胞裂解液与人体全血的体积比为1.6±0.1：1；置于冰上的裂解时间为5-8min；裂解后的离心条件为250±5g/min的速度离心5-10min；重悬细胞时采用不含钙镁的HBSS缓冲液，该HBSS缓冲液与人体全血的体积比为0.6±0.1：1，重悬细胞后将整个液体转移至洁净的分离管中。

5.根据权利要求4所述快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，第四步中，抗体体积与细胞浓度的比例为5±0.5μl：5±0.5×10⁶个/ml；加入磁珠的总体积与抗体体积相同。

6.根据权利要求5所述快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，第四步中，颠倒混匀时采用旋转混合器，在转子转速12±2rpm下匀速转动5-10min；静置时间为8-10min，静置过程中分离管保持开盖；转移过程中保持分离管插在磁铁架中。

7.根据权利要求6所述快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，第三步中，颠倒混匀的动作幅度要轻柔、并保持在确保白细胞不被激活的程度以内；第四步中，将分离管中含细胞的缓冲液转移至洁净的分离管后，加入抗体并置旋转混合器中于转子转速12±2rpm下匀速转动5-10min，加入磁珠并置旋转混合器中于转子转速12±2rpm下匀速转动5-10min，将分离管插入磁铁架中静置至少5min，之后再转移至另一洁净的分离管，即得超高纯度人体血液中性粒细胞。

8.根据权利要求2至7任一项所述快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，第一步中，所述中性粒细胞分离液为HISTOPAQUE-1119，Catalog#RNBH2808；第三步中，所述红细胞裂解液为Fisher/Gibco-Catalog#A1049201；第四步中，所述中性粒细胞磁珠分选试剂盒为Stem cell kit-Catalog#17957，所述抗体为Cocktail抗体，所述磁铁架为EasySep^TMMagnet-Catalog#18000。