[发明专利]快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法

说明书

本发明涉及一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，包括：先将中性粒细胞分离液加入分离管，再将人体全血加至中性粒细胞分离液的上方并形成全血层；将分离管进行离心，使管内液体分为5层，收集中性粒细胞层、以及由中性粒细胞层向红细胞层过渡的液体；稀释后离心弃上清；红细胞裂解并离心弃上清；中性粒细胞磁珠分选。本发明能极大程度地解决其他免疫细胞对中性粒细胞的影响，使得中性粒细胞分离的纯度稳定99％，同时减少了分离时间(全过程约1小时左右)，这对于临床感染性疾病中性粒细胞炎性反应的干预提供了良好的技术平台。

技术领域

本发明涉及一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，属于人血液中性粒细胞分离技术领域。

背景技术

据申请人了解，中性粒细胞是宿主血液中最为丰富的免疫细胞类型，在抵御诸多病原体入侵的过程中发挥第一道防线的作用。中性粒细胞具有活跃的变形运动和吞噬功能，起到非常重要的防御作用；其吞噬对象以细菌为主，同时也吞噬异物。中性粒细胞在骨髓中产生，经过早幼粒、中幼粒、晚幼粒、杆状核和分叶核粒细胞，最终以成熟形式释放到外周血或组织中。需要注意的是，当病原体的负荷超过机体免疫细胞的承载负荷后，会引发炎性的瀑布反应，对生命造成极大威胁，而在临床多种抗感染治疗中，多数仅针对病原微生物体的干预，而针对免疫细胞激活及其引起的炎性因子瀑布效应的干预较少且效果欠佳。免疫细胞种类繁多，细胞间相互作用，作为免疫细胞最为丰富的细胞类型，如何针对这一最大亚群免疫细胞的干预尤为重要。因此，获得超高纯度(纯度大于99％)的中性粒细胞是靶向研究免疫细胞炎性瀑布反应的迫切需求，亦是研究中性粒细胞炎性反应理论的基础。

目前对于中性粒细胞的分离方法有：梯度离心法(如：Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法)，红细胞裂解法，Dextran细胞沉降法等，但却存在较多缺陷。梯度分离法目前使用较多，但在细胞梯度分层时存在与单核细胞等混合，后期获得中性粒细胞数量少，且较多混杂细胞的缺陷；红细胞裂解法虽然简单，但混合大量免疫细胞，纯度较低，不适合免疫细胞炎性的靶向干预；Dextran细胞沉降法存在分离时间长，分离后中性粒细胞被激活甚至出现死亡的情况。因此，亟待研发能快速分离获得超高纯度人体血液中性粒细胞的技术手段。

经检索发现，专利号CN201280057552.5、授权公告号CN103946373B的发明专利，公开了一种用于从含有红细胞的样品中分离细胞的方法，该方法从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中回收所需的细胞，包括：

a)将样品与组合物相接触，该组合物包含：i)红细胞凝集试剂，ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有至少一种抗原识别部分的颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；b)同时应用i)用于红细胞沉降的重力沉降和ii)磁场梯度于样品以用于固定磁性颗粒，从而产生沉淀和上清液相，和c)从上清液相回收所需的细胞。然而，该技术方案并非专门针对中性粒细胞而设计，且成本较高。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的问题，提出一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，能够快速分离获得超高纯度的中性粒细胞，其纯度大于99％，从而为针对中性粒细胞炎性的研究提供技术平台。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、先将中性粒细胞分离液加入分离管，再将人体全血加至中性粒细胞分离液的上方并形成全血层；

第二步、将分离管进行离心，使管内液体分为5层，各层从上至下依次为血浆层、细胞分离液层、单核细胞层、中性粒细胞层、红细胞层，其中血浆层为顶层，红细胞层为底层；先弃去血浆层、细胞分离液层以及单核细胞层，再将中性粒细胞层、以及由中性粒细胞层向红细胞层过渡的液体收集至洁净的分离管中，并弃去作为底层的红细胞层；