[发明专利]柳杉非生物胁迫下miRNA荧光定量内参基因及其专用引物和应用

说明书

本发明公开了柳杉非生物胁迫下miRNA荧光定量内参基因及其专用引物和应用，属于植物分子生物学技术领域。本发明选取10个成熟且表达量较为丰富且稳定的miRNAs及3个常用miRNA的内参基因(5SrRNA，18SrRNA和U6)作为候选基因，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物。通过5种算法评估候选基因的稳定性，获得了适用于柳杉各非生物胁迫下miRNA荧光定量内参基因，填补了柳杉非生物胁迫条件下没有miRNA荧光定量内参基因的现状，为柳杉非生物胁迫条件下miRNA的相关功能基因的表达定量提供了有力的支持，为柳杉miRNA基因功能研究提供了理论基础。

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及柳杉非生物胁迫下miRNA荧光定量内参基因及其专用引物和应用，其中，非生物胁迫包括干旱胁迫，热害胁迫，低温胁迫和盐胁迫。

背景技术

柳杉(Cryptomeriafortunei Hooibrenk)，又名长叶孔雀松，为杉科柳杉属乔木。非生物胁迫因子如干旱、热害、低温、盐害等作用于植物时，会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应。在茶树低温中已有miRNA内参的研究(CN 105132417B)，但仅geNorm和BestKeeper软件进行了内参选择，更没有在多种生物胁迫下进行内参的选择。现在关于柳杉非生物胁迫下miRNA基因的研究还未曾有过报道。柳杉非生物胁迫情况下基因表达的差异的研究过程中，涉及到运用实时荧光定量技术分析和验证基因的表达水平，需要稳定可靠的内参基因，因此筛选柳杉非生物胁迫条件下稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题是提供柳杉非生物胁迫下miRNA荧光定量内参基因；本发明所要解决的第二技术问题是提供柳杉非生物胁迫下miRNA荧光定量内参基因的专用引物；本发明所要解决的第三技术问题是提供上述内参基因或专用引物在柳杉miRNA荧光定量中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

柳杉干旱胁迫下miRNA荧光定量内参基因，为novel16、U6和pab-miR159a基因，novel16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；pab-miR159a基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述的柳杉干旱胁迫下miRNA荧光定量内参基因的专用引物，

novel16基因的引物序列如下：

novel16正向引物：5’-GCGTTTTTCCAATACCTCCTATACC-3’；

novel16反向引物：由试剂盒miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)提供；

U6基因的引物序列如下：

U6正向引物：5’-ACAGAGAAGATTAGCATGGCC-3’；

U6反向引物：5’-GACCAATTCTCGATTTGTGCG-3’；

pab-miR159a基因的引物序列如下：

pab-miR159a正向引物：5’-CGTTGGTTTGAAGGGAGCTCTAC-3’；

pab-miR159a反向引物：由试剂盒miRcute miRNA qPCR Detection Kit(SYBRGreen)提供。

所述的柳杉干旱胁迫下miRNA荧光定量内参基因在柳杉荧光定量中的应用。

所述的柳杉干旱胁迫下miRNA荧光定量内参基因的专用引物在柳杉荧光定量中的应用。