[发明专利]一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、蛋白酶K、结合液、磁珠溶液、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液，上述溶液的溶剂均为去离子水；所述裂解液浓缩制成裂解液冻干粉。

2.如权利要求1所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液冻干粉由pH值为8.0、浓度为0.45-1mol/L的EDTA溶液、浓度为0.5-3mol/L的柠檬酸钠溶液、浓度为0.1-1.3mol/L的海藻酸钠溶液，浓度为0.25-0.8mol/L的十六烷基三甲基溴化胺溶液和体积分数为0.1％-2％的吐温20制备而成。

3.如权利要求1所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述结合液浓缩制成结合液冻干粉。

4.如权利要求3所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述结合液冻干粉由浓度为4-8mol/L的异硫氰酸胍溶液、浓度为0.1-2mol/L的乙酸钠溶液和体积分数为0.1％-1％的曲拉通x-100溶液制备而成。

5.如权利要求3所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述结合液和裂解液冻干粉的制作方法为：在配置好的裂解液和结合液中分别加入0.3％-0.5％的稳定剂，转入1.5ml离心管内，然后置于真空冷冻浓缩仪内，液体经低温冻结、脱水至干粉状，浓缩条件是：冷凝器温度-40～-30℃，加热器转速为10000-13000r，温度为45-56℃，浓缩时间为60-90min。

6.如权利要求5所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为黄原胶和三聚磷酸钠，黄原胶和三聚磷酸钠的质量比为(1-3):(2-5)。

7.如权利要求1所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述磁珠溶液的浓度为30-55mg/mL，磁珠的表面包覆二氧化硅纳米层，内核为四氧化三铁。

8.如权利要求1所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述第一清洗液的pH值为8.0，包括：浓度为5-25mmol/L的Tris-HCl溶液、浓度为8-17mmol/L的氯化钠溶液、浓度为3-5mol/L盐酸胍溶液和体积分数为30％-80％的乙醇溶液；所述第二清洗液包括：浓度为10-20mmol/L的Tris-HCl溶液和体积分数为75％-95％的乙醇溶液。

9.如权利要求1所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括：浓度为8-10mmol/L的Tris-HCl溶液，浓度为0.5-1mmol/L的SDS溶液和浓度为0.1％-1％吐温20。

10.如权利要求1-9任一所述的一种磁珠法提取血浆游离DNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：

S1：在血浆样本置于20-37℃条件下解冻，然后取800-1000μl解冻的血浆，加入裂解液冻干粉0.1-0.12g，震荡混匀，使其沉淀消失；

S2：向1.5ml离心管中加入80-100μl蛋白酶K溶液，涡旋振荡30s使其充分混匀，置于恒温金属浴中，在56℃条件下温浴20-30min，温浴期间震荡1-2次；

S3：取出温浴后的离心管置于20-25℃条件下，并将0.54-0.58g混合液冻干粉加入离心管中，震荡混匀，使沉淀消失；

S4：向步骤S3离心管中依次加入2-3mg磁珠溶液和600-800μl异丙醇，并将离心管置于涡旋混合仪上结合5min，离心3s，然后将离心管置于磁力架上静置30s，待混合液澄清，保持离心管于磁力架上，用移液枪去除上清液；

S5：将步骤S4离心管从磁力架上取下，加入500-700μl第一清洗液后，涡旋振荡30s，然后将离心管放置磁力架上静置30s，待混合液澄清，保持离心管于磁力架上，用移液枪去除上清液；

S6：将步骤S5离心管从磁力架上取下，加入500-700μl第二清洗液后，涡旋振荡30s，然后将离心管放置磁力架上静置30s，待混合液澄清，保持离心管于磁力架上，用移液枪去除上清液；

S7：将步骤S6离心管置于56℃的恒温金属浴内干燥3-5min，取出离心管，加入15-20μl洗脱液，涡旋振荡30s后放置56℃的恒温金属浴内温浴3-5min；

S8：从恒温金属浴中取出步骤S7离心管，并将其放置于磁力架上30s，保持离心管于磁力架上，将离心管中的洗脱液转移至一个新的1.5ml离心管中，即为提取后的血浆游离DNA产物。