[发明专利]一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的试剂盒，包括用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

所述用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统如下a1）-a9）和水组成；

a1）crRNA；

所述crRNA的靶点序列为序列1；

所述crRNA的核苷酸序列为序列2；

所述crRNA在所述系统中的浓度为22.5 nM；

a2）LwCas13a蛋白；所述LwCas13a蛋白的核苷酸序列为序列7，且其在所述系统中的浓度为45nM；

a3）NTP Mix，其按照每50ul所述系统加入4ul量加入；

a4）T7 RNA聚合酶，其按照每50ul所述系统加入1 µL量加入；

a5）RNA酶抑制剂，其按照每50ul所述系统加入2 µL量加入；

a6）MgCl₂溶液，其在所述系统中的浓度为10 mM；

a7）HEPES缓冲液，其在所述系统中的浓度为20 mM；

a8）报告RNA，所述报告RNA由20个U组成，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和与所述侧向流试纸的样品垫标记的纳米金标记兔源抗FITC抗体结合的FAM基团；其在所述系统中的浓度为2 nM；

a9）RT-RAA产物，其按照每50ul所述系统加入5 µL量加入；

所述RT-RAA产物采用的引物为用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；所述RT-RAA扩增引物由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；

所述侧向流试纸按样品流动方向依次包括含有纳米金标记兔源抗FITC抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸；

所述T线由链霉亲和素形成；

所述C线由所述纳米金标记兔源抗FITC抗体的二抗羊抗兔IgG形成。

2.权利要求1所述试剂盒在如下c1-c3任一中的应用：

c1)制备检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒产品；

c2)制备检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒核酸产品；

c3) 制备检测或辅助检测待测样本中是否含有甲型H7N9禽流感病毒核酸产品。

3.一种检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒核酸的方法，所述方法为非疾病诊断治疗目的，其包括如下步骤：

b1、提取待测样本的核酸，用权利要求1所述试剂盒中的RT-RAA扩增引物对待测样本的核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；

b2、将所述RT-RAA扩增产物、权利要求1所述试剂盒中的所述crRNA、权利要求1所述试剂盒中的所述LwCas13a蛋白在含有权利要求1所述试剂盒中的所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；

b3、将所述反应产物加入权利要求1所述试剂盒中的所述侧向流试纸的样品垫的加样孔中，静置观察；

若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有甲型H7N9禽流感病毒核酸；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有甲型H7N9禽流感病毒核酸。