[发明专利]一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR‑Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；所述用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR‑Cas13a系统包括如下a1)‑a3)；a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白；所述crRNA的靶点序列为序列1；a2)报告RNA；a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT‑RAA扩增引物，且所述RT‑RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7RNA聚合酶识别的区域。本发明试剂盒可实现对甲型H7N9禽流感病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到1copy/reaction，特异性达到单碱基。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，涉及一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒。

背景技术

甲型H7N9禽流感病毒可感染禽类和人类，一般在禽类中不致病，而感染人后导致人类发病，且具有死亡率高、预后差、无批准上市的特效药物及无疫苗预防等特点。

甲型流感病毒根据两种表面糖蛋白上抗原——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA) 的不同进行命名。不同种类甲型流感病毒的致病性具有较大差异，其中H7N9病毒是一 种高致病性病原体，而在相应序列中仅存在少量碱基差异的H2N9、H4N9、H5N9、H11N9 等病毒却不具有对人类的致病性。目前针对甲型H7N9禽流感病毒的检测技术包括血清 学检测、荧光定量PCR、恒温扩增核酸检测技术等，均无法实现对少量碱基差异的辨 别。

2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达 到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK (SpecificHigh Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重 组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量 核酸快速、廉价、高灵敏、高特异的检测。

发明内容

本发明一个目的是提供一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的 CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

所述用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)；

a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；

所述crRNA的靶点序列为序列1；

a2)报告RNA，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和与所述侧向流试纸的 样品垫标记的抗体结合的基团；

a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域。

上述试剂盒中，所述crRNA的核苷酸序列为序列2。

上述试剂盒中，所述RT-RAA扩增引物由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示 的单链DNA分子组成。

上述试剂盒中，所述侧向流试纸按样品流动方向依次包括含有纳米金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸；在本发明的实施例中，纳米金标记抗体 为纳米金标记兔源抗FITC抗体；

所述T线由链霉亲和素形成；

所述C线由所述纳米金标记抗体的二抗形成；所述所述纳米金标记抗体的二抗为羊抗兔IgG。