[发明专利]一种利用鸡肝细胞快速分离扩增新型鹅星状病毒的方法

说明书

本发明涉及一种利用鸡肝细胞快速分离扩增新型鹅星状病毒的方法，包括以下步骤：（1）利用鸡肝细胞对鹅星状病毒进行培养；（2）鸡肝细胞快速扩增鹅星状病毒，利用鸡肝细胞对鹅星状病毒进行培养扩增的培养基为含1μg/mL TPCK‑胰蛋白酶的DMEM‑F12培养基；（3）鸡肝细胞能扩增鹅星状病毒，第三天病毒效价可达1.08×10⁶TCID₅₀/ml。通过本发明，这种快速分离扩增方法的建立为快速病毒检测和疫苗的研制提供技术平台，节约时间、成本。因此，本发明在GAstV的病毒检测及疫苗研制中具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种利用鸡肝细胞快速分离扩增新型鹅星状病毒的方法，此发明可快速分离扩增鹅星状病毒，节约时间、成本，可在病毒检测和疫苗研制中具有良好的应用价值。

背景技术

鹅星状病毒(Goose astrovirus, GAstV)是一种能引起雏鹅痛风的无囊膜单股正链RNA病毒。自2015年始,我国不同地区雏鹅陆续发生一种以内脏尿酸盐沉积为主要症状,并伴有关节尿酸盐沉积的传染性疾病,该病主要发生于3周以内的雏鹅，死亡率在20%-70%之间。该病的发生与发展已对我国养鹅业造成了极大危害,并已成为危害养鹅业健康发展的一种重要传染病，严重制约了国内家禽业的健康发展。目前，鹅胚接种是分离GAstV的主要方式，该方法需要在鹅胚上培养7天。本发明以鸡肝细胞作为GAstV病毒分离扩增用细胞，与传统的鹅胚接种相比，GAstV在鸡肝细胞上进行分离扩增仅需要三天就可以获得较高滴度的病毒。因此，利用鸡肝细胞作为病毒分离扩增用细胞，不仅能够快速收获GAstV病毒，为之后病毒的快速检测及疫苗的研制提供技术平台，实现时间和成本缩减。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种利用鸡肝细胞快速分离扩增新型鹅星状病毒的方法，本发明的原理和最核心的关键技术是利用鸡肝细胞能够分离扩增鹅星状病毒，且相对于鹅胚扩增，可以更快的扩增病毒的特性。

本发明的目的是这样实现的，一种利用鸡肝细胞快速分离扩增新型鹅星状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用鸡肝细胞对鹅星状病毒进行培养；

（2）鸡肝细胞快速扩增鹅星状病毒，利用鸡肝细胞对鹅星状病毒进行培养扩增的培养基为含1μg/mL TPCK-胰蛋白酶的DMEM-F12培养基；

（3）鸡肝细胞能扩增鹅星状病毒，第三天病毒效价可达1.08×10⁶TCID₅₀/ml。

步骤（1）中，步骤为：

鸡肝细胞采用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基进行培养，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以0.25%的胰酶进行消化、传代至所需的细胞培养板中。

步骤（2）中，步骤为：

将鸡肝细胞接种至6孔板内培养，在汇合度为约70%时，将鹅星状病毒接种细胞，MOI为0.1，做两个重复，以含1μg/mL TPCK-胰蛋白酶的DMEM-F12培养基培养5天，每天收集200μl上清冻于-80℃冰箱备用，同时每孔补200μl含1μg/mL TPCK-胰蛋白酶的DMEM-F12培养基；测定收集上清的TCID₅₀；利用GraphPad Prism 6软件绘制鹅星状病毒生长曲线。

步骤（3）中，病毒在鸡肝细胞上培养到第三天的时候达到最高病毒滴度1.08×10⁶TCID₅₀/ml，然后在第四天和第五天缓慢下降。

通过本发明，公开了可以快速分离扩增新型鹅星状病毒的鸡肝细胞。本发明还公开鸡肝细胞快速扩增鹅星状病毒的方法。本发明的技术方案为：

1）细胞培养；鸡肝细胞采用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基进行培养，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以0.25%的胰酶进行消化、传代至所需的细胞培养板中。

2）鸡肝细胞快速分离扩增鹅星状病毒；