[发明专利]两种改造的低免疫原性黄精凝集素蛋白

权利要求书

1.一种低免疫原性黄精凝集素改造蛋白，其特征在于，所述改造蛋白为mrPCL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种改造的黄精凝集素的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子如SEQ ID NO:3所示。

3.一种低免疫原性黄精凝集素改造蛋白，其特征在于，所述改造蛋白为mrPCL5，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一种改造的黄精凝集素的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子如SEQ ID NO:5所示。

5.一种权利要求1或3所述的黄精凝集素改造蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将PCL的氨基酸序列第19位、第100位氨基酸进行单突变，置换后的序列如SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:4所示；设计合成RFP-g4s-mrPCL2基因，氨基酸序列SEQ ID NO：6，核酸序列见SEQ ID NO：7、RFP-g4s-mrPCL5基因，氨基酸序列SEQ ID NO：8，核酸序列见SEQ ID NO：9；

（2）构建改造的黄精凝集素重组质粒：将RFP-g4s-mrPCL2基因、 RFP-g4s-mrPCL5基因分别插入到载体p ET-21a的Nde I和Hind III限制酶切位点上；

（3）构建含有RFP-g4s-mrPCL2基因、RFP-g4s-mrPCL5基因的重组表达菌株：将重组质粒转化到克隆菌DH5α中提取质粒，最后转化到表达菌Rosetta-gami B（DE3）plyss中；

（4）黄精凝集素改造蛋白mrPCL2、mrPCL5的制备：挑取表达菌Rosetta-gami B（DE3）plyss单克隆接种于5ml含15µg/ml Kan，100µg/ml Amp，34µg/ml Cam，12.5µg/ml Tet的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养过夜，次日按1：100比例转接入含Kan的LB培养基中后，37℃，200rpm振荡培养，使OD值达到0.5-0.6后，取部分菌液作为诱导前的对照，加入IPTG使得终浓度为0.5 mmol/L，37℃，200rpm振荡诱导培养12 h，诱导目的蛋白的表达，8000rpm离心10min，收集诱导表达后菌体，用镍柱结合缓冲液Binding Buffer：20mMPB，500mMNaCl，10mM咪唑，pH=7.4，悬浮菌体，加入1mM PMSF，进行超声，超声功率为52W，超声3s，间隔7s，90次，超声两个循环，总时间30min，将超声后的总蛋白样品8000rpm，4℃，离心10min，收集上清蛋白样，过0.22μm滤膜除去不溶物，开始上样于预先已经用Binding Buffer平衡好的Ni²⁺-Sepharose Fast Flow 亲和层析柱，上完样后，用Wash Buffer洗涤层析柱清洗未挂柱蛋白，最后用250mM咪唑浓度进行洗脱，收集洗脱液；后使用肠激酶和分子筛层析对融合蛋白进行酶切和分离，获得突变体蛋白，用dd H2O超滤，随后冻干。

6.权利要求1或3 所述的黄精凝集素改造蛋白在制备抗肿瘤细胞增殖活性药物中的应用。