[发明专利]两种改造的低免疫原性黄精凝集素蛋白有效

专利信息
申请号: 202110323835.0 申请日: 2021-03-26
公开(公告)号: CN113121665B 公开(公告)日: 2023-03-10
发明(设计)人: 鲍锦库;吴传芳;郑茹潇;曹东炜;王意达;陈宣铭;李洋均;邓杰;周洵羽 申请(专利权)人: 四川大学
主分类号: C07K14/42 分类号: C07K14/42;C12N15/29;C12N15/70;A61K38/16;A61P31/18;A61P35/00;C12R1/19
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 610065 四川省成*** 国省代码: 四川;51
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摘要:
搜索关键词: 改造 免疫原性 黄精 凝集素 蛋白
【说明书】:

发明公开了两种高活性、低免疫原性的突变型黄精凝集素蛋白。属于生物技术领域。本发明以野生型黄精凝集素序列为基础,通过生物信息学分析结合免疫信息学方法设计了低免疫原性的突变蛋白mrPCL2(突变位点G19Q)和突变蛋白mrPCL5(突变位点P100R),利用重组技术将两个突变序列分别与pET21a载体进行连接,构建了融合表达重组质粒。将质粒转入原核表达系统Rosettatm‑gami B(DE3)plyss宿主菌中诱导表达,然后利用Ni2+‑Sepharose柱亲和层析等手段获得大量的突变型蛋白。实验证明本发明获得的突变型黄精凝集素具有高纯度、高活性、低毒性、低免疫原性的特征,对肿瘤细胞具有良好的抑制效果。本发明为黄精凝集素的药物开发及应用打下了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域,具体涉及两种低免疫原性黄精凝集素重组突变体的制备与应用。

背景技术

黄精凝集素(Polygonatumcyrtonemalectin,PCL)是一类提取自黄精根茎的糖结合蛋白,具有典型的凝集素活性(凝集血细胞和糖结合活性)。PCL对甘露糖具有结合专一性,也可有效结合唾液酸。而HIV病毒粒子表面的gp120具有大量甘露糖和唾液酸,肿瘤细胞表面也异常表达许多唾液酸化的T抗原和Tn抗原,因此PCL可以与gp120、肿瘤细胞表面的甘露糖和唾液酸结合,从而有效的封闭和阻断gp120与宿主细胞表面CD4的识别和结合,具有高效抑制肿瘤活性、抗HIV感染的作用。

PCL对正常细胞显示出很低的毒性,具有很低的毒副作用,显示出良好的成药性。但作为人体的异己蛋白,黄精凝集素具有较强的免疫原性,进入体内易激活机体的自身免疫反应,产生中和性抗体影响疗效。目前将具有抗肿瘤、抗病毒的天然提取物和大分子药物应用到未来临床治疗中,均面临同PCL一样需减少不必要免疫原性的重大问题。

抗原的特异性取决于抗原表位的性质、数目和空间构型,而表位是蛋白质抗原性的基础。深入研究蛋白质表位对多肽和新型疫苗分子的设计及诊断试剂的开发具有重要意义。现今采用免疫信息学方法、生物信息学工具对抗原表位进行预测已成为表位确定的强有力工具。

故此本发明利用生物信息学工具对PCL抗原表位进行预测,选取目标肽段进行氨基酸突变并与中国人群中分布频率较高的主要组织相容性复合物进行分子对接模拟,确定结合紧密性显著降低的两种单点突变,并进行实验验证。构建重组PCL突变体,原核表达后纯化、检测其理化性质和抗肿瘤活性,最终获得两种高效低免疫原性黄精凝集素重组突变体。

目前还未有降低免疫原性的PCL重组蛋白相关报道,本发明为免疫原性较强的新型药物,如免疫毒素、植物凝集素等免疫原性的降低和研究开发提供了新的思路,同时为创制新一代具有抗病毒、抗肿瘤活性并具有低免疫原性的创新药物提供理论和技术支持,以及为降低天然药物的免疫原性、减少大分子药物毒副作用,避免其在体内产生大量中和性抗体的技术难题提供基础研究支持。

发明内容

为了在保证活性的情况下降低黄精凝集素PCL的免疫原性,本发明通过改造黄精凝集素PCL的基因,获得成功表达的高效低免疫原性黄精凝集素突变体mrPCL2和mrPCL5。

本发明的第一个方面,提供了两种改造的高效低免疫原性黄精凝集素,所述改造的突变体黄精凝集素mrPCL2是将PCL的氨基酸序列SEQ ID NO:1 第19位的甘氨酸替换为谷氨酰胺;突变体黄精凝集素mrPCL5是将PCL的氨基酸序列SEQ ID NO:1 第100位的脯氨酸替换为精氨酸;蛋白缩写见下表1。

本发明第二方面,提供两种改造高效低免疫原性黄精凝集素的制备方法,包括如下步骤:

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