[发明专利]一种Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质的检测方法

说明书

本发明涉及一种Fmoc‑Pbf‑精氨酸有关物质检测方法，其参数条件如下：检测波长为220nm，所用流动相为乙腈和水，加醋酸，梯度变化中乙腈体积含量为50～85～50％，水的体积含量为50～15～50％；检测时所用的色谱柱的固定相为十八烷基硅烷。本发明提供的Fmoc‑Pbf‑精氨酸有关物质检测方法，检测速度较快，结果准确，杂质分离度好，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及多肽领域，具体涉及一种Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质的检测方法。

背景技术

芴甲氧羰酰-精氨酸(PBF)，Fmoc-Arg(pbf)-OH，又名Fmoc-Pbf-精氨酸、N-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸、Nα-FMOC-Nω-PBF-L-精氨酸或Fmoc-保护基精氨酸，其结构如下所示：

精氨酸是人体必需的氨基酸之一，是合成多肽的重要原料。由于精氨酸呈碱性及含有多个官能团，使得研究其性质及对多肽合成时不能直接使用，必须对其氨基和侧链胍基进行有效的保护，而pbf对酸最敏感，在TFA/H₂O体系中常温就能方便的脱除，因此pbf是应用最为广泛的精氨酸保护基，因此，开发一种Fmoc-Pbf-精氨酸的检测方法具有重要的工业价值。

公开号为CN109115899A的中国发明专利公开了一种Fmoc氨基酸的分析方法，但其没有提到有关物质，申请人重复了其使用的方法，发现其对主要杂质的分离度也不够理想。

醋酸酸性较三氟乙酸弱，且三氟乙酸一般禁用于质谱分析，因为三氟乙酸根信号很强，会掩盖几乎所有的负离子，甚至污染质量分析器。现有的方法是用三氟乙酸体系测Fmoc-Arg(pbf)-OH有关物质，TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1％，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响色谱柱寿命。本发明用醋酸体系和三氟乙酸体系也做了对比，结论醋酸体系对检测Fmoc-Arg(pbf)-OH有关物质在分离度，以及保护色谱柱方面更有优势。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种操作方便快捷、结果准确的Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质检测方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质检测方法，参数条件如下：

检测波长为220nm，所用流动相为乙腈和水，加醋酸，梯度变化中乙腈体积含量为50～85～50％，水的体积含量为50～15～50％。

优选的，所述有关物质检测方法中色谱柱可以选自固定相为十八烷基硅烷的色谱柱；具体的，可以选用ZORBAX ODS 4.6mmx250mm 5μKromasil 100A C18 5u 250*4.6mm，SinoChrom ODS-BP 5μ4.6mmx250mm，Symmetry Shield RP18 5um 4.6*250mm,SynergiMAX-RP 4.6mmx250mm 5μ的C₁₈柱色谱柱。

优选的，所述有关物质检测方法中柱温为20～30℃，流动相流速为0.8～1.2ml/min。

进一步的，所述有关物质检测方法中柱温为25℃，流动相流速为1ml/min。

优选的，所述有关物质检测方法中直接采用流动相溶解样品，进样浓度为0.25～0.75mg/ml。

优选的，所述有关物质检测方法中不使用对照品溶液，而直接采用面积归一化法计算Fmoc-Pbf-精氨酸的纯度。

优选的，所述有关物质检测方法中流动相中醋酸的添加量为0.1％(体积比)。

优选的，有关物质检测方法中洗脱梯度变化为：