[发明专利]基于AFM1抗独特型纳米抗体替代抗原的VHH-ELISA方法

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及基于AFM1抗独特型纳米抗体替代抗原的VHH‑ELISA方法。本发明采用VHH C4作为替代包被抗原建立的VHH‑ELISA进行样品添加回收实验，表明黄曲霉毒素M₁抗独特型纳米抗体替代抗原VHH‑ELISA法结果准确、可靠，是一种有效、可行的免疫分析方法。能够应用于黄曲霉毒素M1的污染检测。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种黄曲霉毒素M₁抗独特型纳米抗体作为黄曲霉毒素M₁抗原替代物的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是由黄曲霉或者寄生曲霉产生的代谢物，它们污染了多种农产品，在农作物的生长、收获、贮存和加工过程中均被发现。这些代谢物是剧毒，致突变，致畸和致癌的化合物，已被认为是人肝和肝外致癌作用的致病因子。黄曲霉毒素B₁(AFB₁)毒性最高，被国际癌症研究机构归为1类人类致癌物。AFM₁是AFB₁的羟基化代谢产物。摄取被AFB₁污染的饲料的泌乳动物会将AFM₁排泄到牛奶中，因此可以在各种各样的牛奶产品中找到它。AFM₁也具有毒性和致癌作用，已被分类为1类致癌物。由于AFM₁污染对人体健康(特别是对婴儿和儿童)的危害，已成为全球关注的问题。欧盟对牛奶中AFM₁的限制为0.05ng/mL。但是，中国、美国和巴西的限定标准均为0.5ng/mL。

先前已经建立了许多用于AFM₁检测的方法。高效液相色谱(HPLC)和荧光检测(FD)成功取代了薄层色谱法(TLC)，仍然是应用最广泛的方法之一。目前，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)和电喷雾电离四极杆飞行时间质谱已经开发了。所有这些步骤都依赖昂贵的成本，设备完善的实验室和几个小时，从而削弱了它们在AFM₁检测中的应用。另一方面，酶联免疫吸附测定(ELISA)由于其成本低廉且易于应用而变得越来越流行。免疫学方法适用于快速检测黄曲霉毒素。ELISA检测方法所需样品量少，是一种高通量测定AFM₁的常规分析方法。由于AFM₁为小分子物质，不能单独作为抗原，因此常与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)等偶联后作为完全抗原后使用。但是，完全抗原的合成工艺复杂且昂贵，需要使用大量的AFM₁标准品，不仅对操作人员造成极大的威胁，同时还可能会对环境造成二次污染。因此，抗独特型抗体(Anti-Idiotype)的提出可以为此提供解决方案，识别独特型抗体可变区的抗独特型抗体模仿了抗原的三维结构，这些抗原表达了Jerne所描述的免疫学“内部图像”，并且模仿抗原的构型，所以抗独特型抗体可以用作AFM₁抗原替代品来开发一种ELISA的安全形式。

发明内容

本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种基于AFM1抗独特型纳米抗体替代黄曲霉毒素M₁标准品的ELISA免疫分析方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

提供黄曲霉毒素M₁抗独特型纳米抗体作为黄曲霉毒素M₁抗原替代物的应用，所述黄曲霉毒素M₁抗独特型纳米抗体为黄曲霉毒素M₁抗独特型纳米抗体VHH C4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

按上述方案，编码黄曲霉毒素M₁抗独特型纳米抗体氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。