[发明专利]一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用

权利要求书

1.一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒，其特征在于，包括如下组分：抗原修复液、维多利亚蓝染液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂A、二抗试剂B、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、HRP-Blue底物、HRP-Blue底物缓冲液液、苏木素复染液；

其中，所述一抗试剂为主要由抗体A和抗体B组成的混合抗体，所述抗体A为鼠单克隆抗体，所述抗体B为兔单克隆抗体；

所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；

所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体A为抗TTF-1鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗p40兔单克隆抗体；或所述抗体A为p40鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗TTF-1兔单克隆抗体；或所述抗体A为抗ER鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗Her2兔单克隆抗体；或所述抗体A为Her2鼠单克隆抗体，所述抗体B为抗ER兔单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原修复液为柠檬酸修复液(pH6.0)或EDTA修复液(pH9.0)。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述维多利亚蓝染液主要由维多利亚蓝、间二苯酚、三氯化铁组成。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述维多利亚蓝染液的配制方法包括如下步骤：

1)维多利亚蓝2.0g，糊精0.5g，间二苯酚4.0g，蒸馏水200ml，混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min；

2)将30％三氯化铁水溶液25ml煮沸后加入上述混合液中，继续煮沸3min，要不断搅拌，搅拌棒上会出现胶样物质；

3)终止加热，冷却后过滤；

4)将滤纸上的物质连同滤纸放入60℃恒温箱中烤干；

5)将烤干的蓝色粉末连同滤纸溶于400ml 70％乙醇中；

6)加浓盐酸4ml，苯酚5g，苯酚不能溶解时可略加温溶解，放置成熟后使用。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括95％乙醇和/或清洗液，所述清洗液为PBST缓冲液(pH7.4)或TBST缓冲液(pH8.0)。

7.一种免疫组化联合弹性纤维多重染色方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)脱蜡和水化：由二甲苯到无水乙醇，再到95％、85％、75％梯度乙醇浸泡，至水化；

2)抗原修复；

3)弹性纤维染色：95％乙醇稍洗，维多利亚蓝染液常温孵育1小时；

4)分化：95％乙醇快速浸洗至无多余染液；

5)纯化水浸泡，冲洗；

6)加过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min，清洗液洗涤；

7)加一抗试剂，室温孵育60min，清洗液洗涤；

8)加二抗试剂A，室温孵育30min，清洗液洗涤，所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；

9)DAB显色：加入新鲜配制的DAB染色液，室温孵育5～10min，纯化水冲洗；

10)加二抗试剂B，室温孵育30min，清洗液洗涤，所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物；

11)HRP-Blue显色：加入新鲜配制的HRP-Blue染色液，室温孵育5～10min,纯化水冲洗；

12)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

8.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，所述步骤2)抗原修复采用高压修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片先经过二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，盖紧锅盖，待冒气后，开始计时2.5分钟，离开热源5分钟，流水下冲凉。

9.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，所述步骤2)抗原修复采用微沸修复法，包括如下步骤：电压力锅中加入抗原修复液，将组织切片不经二甲苯脱蜡后，浸泡于抗原修复液中，待修复液微沸后，开始计时30分钟；离开热源5分钟，流水下冲凉。

10.如权利要求1-6任一项所述的试剂盒、如权利要求7-10任一项所述的染色方法在肿瘤病理组织染色中的应用。