[发明专利]一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用

说明书

本发明涉及一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用。本发明提供的试剂盒包括如下组分：抗原修复液、维多利亚蓝染液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂A、二抗试剂B、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、HRP‑Blue底物、HRP‑Blue底物缓冲液液、苏木素复染液；其中，所述一抗试剂为主要由抗体A和抗体B组成的混合抗体，所述抗体A为鼠单克隆抗体，所述抗体B为兔单克隆抗体；所述二抗试剂A为HRP酶标记的羊抗鼠聚合物；所述二抗试剂B为HRP酶标记的羊抗兔聚合物。本发明还提供了具体染色方法。本发明的试剂盒及染色方法首次将免疫组化双重染色和弹性纤维染色有机结合，简化染色程序，提高检测效率，对组织样本的需求量显著降低。

技术领域

本发明属于临床病理检测技术领域，具体涉及一种免疫组化联合弹性纤维多重染色试剂盒、染色方法及应用。

背景技术

免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)又称免疫细胞化学染色，简称免疫组化，是病理学诊断、鉴别诊断、肿瘤特异性分子靶标筛选、鉴定的最重要平台性技术。近年来，在恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；确定转移性恶性肿瘤的原发部位；对某类肿瘤进行进一步的病理分型；应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；发现微小转移灶，有助于临床治疗方案确定，包括手术范围的确定；为临床提供治疗方案的选择等多方面都得到了广泛应用。

在过去的几十年间，一种称为“免疫组化双染技术(dual-staining)”应运而生(Hofman FM,et all.2013；Ojima T,et al.2013；刘洪博,等,2016；张爱凤,等,2010；石磊,等.2017；朱长乐,等.2014.)。现有免疫组化双染技术是采用针对两种不同分子靶标的特异性抗体、两种不同酶标的二抗(如过氧化物酶和碱性磷酸酶)和相应的两种能呈现不同颜色的显色底物，将两种分子靶标显示为两种不同颜色，从而实现在同一张组织切片上检测两个分子靶标的目的。

恶性肿瘤是一类生长迅速、转移早、预后差的异质性疾病，而良恶性鉴别、临床分期、瘤细胞浸润范围或深度等因素决定后续的治疗。病理医师采用HE染色对肿瘤组织进行病理学诊断，虽然HE染色能较好地识别肿瘤细胞，但有些情况下对于侵犯深度和范围的判断并不十分准确，在某些特殊类型恶性肿瘤的鉴别诊断中也有局限性。特殊染色是一种传统的化学染色技术，随着免疫组化技术的广泛应用以及分子病理学技术的逐渐普及，特染染色的应用受到限制甚至萎缩，但一部分特殊染色项目在肿瘤诊断中仍具有重要价值。由于特殊染色试剂盒的标准化和商品化，其使用较以前更为方便，传统的特殊染色应用又焕发出生机。在众多的特殊染色项目中，弹力纤维染色能够较好的显示浆膜下层、肿瘤周边血管中的弹力纤维组织，对HE染色难以判断的恶性肿瘤诊断问题提供了新的解决方法。

弹力纤维在新鲜标本中呈黄色发亮的细线条状，在HE切片中呈淡红，不易与胶原纤维区分，可通过弹力纤维染色识别。弹力纤维染色主要机制是带负电荷的弹性蛋白(含二硫键及酸性基团)与带有弱正电荷的染料通过非极性吸着完成染色。在弹性纤维染色中，通常采用高锰酸钾先氧化组织上的各种蛋白，然后用草酸清洗掉组织上的高锰酸钾染色液，维多利亚蓝染色液与组织进行染色，其中间二苯酚是维多利亚蓝与弹性纤维上被氧化蛋白结合的媒介物，再通过95％乙醇脱掉组织上多余的维多利亚蓝染色液。能够特异性的将弹性纤维染成蓝色，亦显示肥大细胞颗粒、脂褐素、嗜酸性细胞等。

弹力纤维染色目前在恶性肿瘤中(如肺癌、结直肠癌以及黑色素瘤等)主要用于判断是否存在血管受侵、评估肿瘤浸润深度及某些肿瘤的鉴别诊断。

(1)弹力纤维染色在肺癌中的诊断价值脏层胸膜受侵是肺癌术后患者最重要的不良预后因素之一；

(2)弹力纤维染色在结直肠癌中的诊断价值在第7版AJCC分期中，结直肠癌T分期仍完全依赖于肿瘤侵犯深度的组织学评估；

(3)弹力纤维染色在其他恶性肿瘤中的诊断价值弹力纤维染色在评估食管癌血管受侵以及黑色素瘤的鉴别诊断中均有较大价值。

表1弹力纤维染色在恶性肿瘤中的研究及意义