[发明专利]一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，包括：无菌切取肿瘤组织置于培养液中，在无菌冷链条件下将瘤体机械剪碎、消化，获取单细胞悬液，分离提取肿瘤浸润T淋巴细胞，加入到含有分离诱导培养液的培养基中进行体外扩增和诱导分化，培养7–21天得到高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞，分离诱导培养液为含有IL‑2、IL‑7、IL‑15浓度分别为10ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的培养基。本发明通过分离诱导培养液对TIL细胞进行体外扩增和诱导分化，最大限度获得具有高效增殖活性及强大肿瘤杀伤能力的高记忆表型TILs，方法简单且高效，记忆表型T淋巴细胞占比高，可用于治疗晚期恶性黑色素瘤。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞(TILs)的培养方法。

背景技术

恶性黑色素瘤(简称黑色素瘤)是恶性程度最高的皮肤肿瘤，近年来发病率以每年3％–5％的速度增长。手术可以切除早期黑色素瘤，但黑色素瘤发生远处转移后常规治疗有效率低，5年生存率仅为10％–20％，中位生存时间仅6–9个月，预后极差。黑色素瘤具有极高的突变负荷及免疫原性，免疫治疗在黑色素瘤中疗效尤为显著，然而超过50％的黑色素瘤患者仍对免疫治疗无应答，部分患者发生肿瘤爆发性进展，因此，优化免疫治疗手段、探索更佳联合治疗方案，具有重要的临床意义。

免疫治疗依赖于肿瘤细胞与其微环境内免疫细胞之间的相互作用。然而，肿瘤局部呈现出抑制性微环境，表现为效应淋巴细胞浸润减少及功能耗竭，对肿瘤细胞的杀伤活性大大降低，这就使得依赖于T细胞的免疫治疗药物无法发挥作用。因此，增加肿瘤微环境局部T细胞比例及改善其功能状态，尤其是增加记忆表型T细胞的比例，对于抵抗肿瘤发生发展及提高免疫治疗效果具有十分重要的作用。过继性免疫治疗(adoptiveimmunotherapy，AIT)是指将体外扩增的免疫细胞回输患者体内，以改善肿瘤局部的抑制性免疫微环境，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，从而抑制肿瘤进展或联合免疫治疗，它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，其中非特异激活是采用非特异性刺激因子(如IL-2、IFN-γ等)刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等。然而，效应T细胞寿命短，无法维持长时间的抗肿瘤免疫应答。

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)是从肿瘤组织中分离出的淋巴细胞，是一种特异性免疫活性细胞疗法。现有的TIL细胞分离培养技术，主要是机械处理和酶消化法、非连续密度梯度离心法等，从肿瘤局部分离出肿瘤浸润的淋巴细胞，再加入高剂量白细胞介素-2(IL-2)进行体外培养。与淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)相比，TIL具有更高的抗瘤效价，较LAK强50–100倍，在治疗中可以减少效应细胞和IL-2的用量；TIL主要由CD8+T细胞诱导而来，其杀伤肿瘤的作用具有特异性；消除宿主肿瘤免疫微环境的抑制状态有利于TIL的杀伤作用。TIL细胞作为一种特异性免疫细胞，用于肿瘤治疗已有数十年的历史。目前常用的TIL体外扩增技术是先从肿瘤组织中分离出TIL细胞后再进行诱导培养，存在扩增速度慢、记忆性淋巴细胞数量少等缺陷，并且为了快速获得更多的效应细胞，细胞因子(如IL-2)剂量较高，在治疗过程中容易使患者产生细胞因子风暴，不利于治疗，甚至对患者产生生命危险。Rosenberg指出，肿瘤组织中占比很小的记忆性T细胞维持肿瘤特异性突变抗原，是深入到敌军内部打击能力最强的免疫细胞。因此，可以在TIL体外扩增的过程中调整诱导因子的组合，使其向着记忆表型方向扩增，这种获得的TILs具有较高的记忆T细胞占比，因而具有强大而持久的抗肿瘤免疫应答能力。

发明内容

本发明的第一目的是，提供一种高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞的培养方法，解决现有TIL细胞扩增方法存在操作程序繁杂、耗时长、活性不高、记忆性淋巴细胞占比较低等问题。

本发明的第二目的是，提供所述高记忆表型肿瘤浸润T淋巴细胞在制备用于治疗晚期恶性黑色素瘤的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：