[发明专利]一种自发类风湿性关节炎小鼠模型的构建方法

说明书

本发明涉及类风湿性关节炎小鼠动物模型的构建方法。根据人类患者全基因组测序结果进行筛查，发现了其SYK基因特定位点存在点突变并预测其极有可能为致病突变，因此对比小鼠Syk基因序列，利用不同方法成功获得了Syk基因特定位点点突变的基因工程小鼠，该小鼠具备典型的类风湿性关节炎患病特征，为人类类风湿性关节炎的致病机制及治疗研究奠定了一定理论基础。

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，具体为一种类风湿性关节炎小鼠疾病模型的构建方法。

背景技术

类风湿性关节炎（RA）是一种发病率较高的自身免疫疾病，目前认为其主要发病原因是遗传因素和环境因素的共同作用，导致机体错误识别自身抗原产生自身抗体，免疫细胞大量浸润侵蚀关节软骨及周围骨，造成患者持续性关节损伤，关节肿痛、畸形甚至致残，还伴随着诸多并发症，严重影响患者的生活质量。尽管近些年来针对类风湿性关节炎的临床研究和治疗资源较多，但是还没有能够治愈类风湿性关节炎的方法，目前使用最多的RA药物甲氨蝶呤虽然能有效缓解病症，但是其副作用较大，并且很多病人对其不耐受，其他相关药物或者手术治疗手段也同样无法根治此病。因此针对RA的安全有效的临床药物开发以及精确诊断与治疗仍然是此领域亟待解决的问题。

目前使用的类风湿性关节炎动物模型大多是诱导模型，自发炎症模型很少，根据病人基因组测序结果构建的疾病模型更加少见，而此类根据病人测序结果所构建的自发炎症模型对于人类疾病机制的研究十分重要。

发明内容

本发明的目的是利用转基因技术构建获得与人类患者基因测序突变位点一致的自发RA小鼠疾病模型，对该模型进行表型鉴定并探究治疗RA的方法。

本发明提供了一种自发类风湿性关节炎小鼠模型的构建方法，根据临床病人的测序结果发现的SYK基因新发激活型点突变，并利用基因工程技术构建与病人突变位点一致的自发RA小鼠模型。

本发明第一方面提供给了可能会导致小鼠自发关节炎发生的SYK氨基酸序列的突变，包括Syk-Ser544Tyr或Syk-Ser544Phe，即小鼠Syk基因544位氨基酸由丝氨酸Ser变为酪氨酸Tyr或苯丙氨酸Phe；或Syk-Met444Ile，即小鼠Syk基因444位氨基酸由甲硫氨酸Met变为异亮氨酸Ile；或Syk-Ala347Thr，即小鼠Syk基因347位氨基酸由丙氨酸Ala变为苏氨酸Thr；或Syk-Pro336Phe，即小鼠Syk基因336位氨基酸由脯氨酸Pro变为苏氨酸Thr；或者通过将上述Syk突变随机组合；或者通过删除Syk片段得到激活型的Syk基因或者cDNA。

进一步的，本发明所述基因工程构建技术方法为利用CRISPR-CAS9技术，通过同源重组将本发明所述突变定点引入到Syk基因中。

进一步的，本发明所述基因工程构建技术方法为利用转座酶系统将所述的点突变整合到小鼠体内。

进一步的，本发明所述基因工程构建技术方法为用病毒或非病毒感染的方式将所述的点突变整合到造血干细胞，随后再移植到小鼠体内。

进一步的，本发明提供的CRISPR-CAS9技术构建方法为：

a)设计靶向小鼠Syk基因目的突变位点的sgRNA，并构建sgRNA表达载体；

b)通过体外转录分别得到上述sgRNA及表达Cas9的mRNA；

c)将转录好的上述sgRNA与Cas9 mRNA进行纯化，并检测其浓度；

d)合成单链DNA模版ssOligo；

e)将制备好的上述样品按照终浓度均为50ng/ul进行混合；

f) 进行胚胎的显微注射，完成注射后将胚胎移植到假孕母鼠的子宫内，