[发明专利]用于流式细胞学检测的活细胞胞内或核内染色方法

说明书

本发明公开了用于流式细胞学检测的活细胞胞内或核内染色方法，包括如下步骤：A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt‑MEM培养液按重量份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；A2：将活细胞抗体和opt‑MEM培养液按重量份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；A3：将混合液1和混合液2按重量份数比54:51充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；A4：将混合液3加入到含有PBS溶液的活细胞悬液中，得到混合液4，所述混合液3和PBS溶液重量份数比为21:40，混合液4在温度5.37℃、避光环境中孵育30分钟，用PBS溶液清洗2遍，完成染色。本发明不需要进行细胞膜打孔，保证了细胞活性；同时，该方法只需要1个小时即可，时间明显缩短。

技术领域

本发明涉及免疫分析和生物技术应用领域，具体涉及用于流式细胞学检测的活细胞胞内或核内染色方法。

背景技术

目前国内的活细胞染色方法包括：1、中国专利“活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法”，专利号“201410061287.9”，该方法利用脂质体作为载体进行细胞内染色，方法需要22-26个小时且只针对直接带有荧光标记的抗体；2、中国专利“一种活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法”，专利号“201910633999.6”，该方法对细胞活性有一定的影响，且染色效率不高。

目前常规的用于流式细胞学的胞内或核内荧光染色一般通过细胞膜打孔实现。细胞膜打孔会影响细胞活性，容易造成细胞死亡，增加细胞碎片的产生，影响流式细胞学检测结果。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了用于流式细胞学检测的活细胞胞内或核内染色方法，不需要进行细胞膜打孔，保证了细胞活性的前提下，对细胞胞内或核内抗原进行荧光染色；同时，该方法只需要1个小时即可，时间明显缩短。

本发明通过下述技术方案实现：用于流式细胞学检测的活细胞胞内或核内染色方法，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:12-14充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:45-55充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比50-55:51-54充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到含有PBS溶液的活细胞悬液中，得到混合液4，所述混合液3和PBS溶液体积份数比为50-55:100，所述混合液4在温度35-40℃、避光环境中孵育25-30min，用PBS溶液清洗1-2遍，完成染色。

进一步，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到含有PBS溶液的活细胞悬液中，得到混合液4，所述混合液3和PBS溶液体积份数比为53:100，所述混合液4在温度37℃、避光环境中孵育30min，用PBS溶液清洗2遍，完成染色。

进一步，所述步骤A2中，活细胞抗体为细胞核内蛋白一抗和二抗混合物，一抗和二抗的重量份数比为1:1。

进一步，所述步骤A2中，活细胞抗体为荧光标记的细胞内蛋白抗体。

进一步，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：

B1：将去离子水加热至75-85℃，加入线性聚乙烯亚胺，充分溶解后，冷却到室温，得到冷却溶液，所述去离子水和线性聚乙烯亚胺的重量份数比为：500:1；