[发明专利]干细胞分化诱导为肝细胞的方法

权利要求书

1.一种干细胞分化诱导为肝细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

步骤（1），在添加有Activin A和Wnt信号通路激动剂的第一培养基中培养干细胞，收集细胞，所述Wnt信号通路激动剂为CHIR；和

步骤（2），在添加有BMP2和FGF4的第二培养基中培养步骤（1）所得的细胞，收集细胞；和

步骤（3），在添加有HGF和KGF的第三培养基中培养步骤（2）所得的细胞，收集细胞；和

步骤（4），在添加有Vc、EGF和胰岛素的第四培养基中培养步骤（3）所得的细胞，收集细胞，获得所述肝细胞；

所述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；

其中，步骤（2）、步骤（3）以及步骤（4）中，所述的培养为悬浮培养；

在所述第一培养基中，所述Activin A的含量为10~120 ng/mL；

所述Wnt信号通路激动剂的含量0.1-4 µM；

在所述第二培养基中，所述BMP2的含量1-30 ng/mL；

所述FGF4的含量1-40 ng/mL；

在所述第三培养基中，所述HGF的含量1-30 ng/mL；

所述KGF的含量1~30 ng/mL；

在所述第四培养基中，所述Vc的含量1~80μg/mL；

所述EGF的含量1-30 ng/mL；

所述胰岛素的含量0.1-3 µg/mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述悬浮培养在细胞培养反应器中进行，所述细胞培养反应器包括容器本体和控制装置，进行悬浮培养时，将待培养的细胞置于容器本体中，通过所述控制装置控制所述容器本体通过预设的方式运动。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预设的方式为旋转、回旋、摇摆、振荡或其组合；

其中，所述旋转为绕所述细胞培养反应器的中心轴线进行圆周运动；

所述回旋为绕偏离所述细胞培养反应器中心的轴线进行偏心回转；

所述摇摆为沿垂直于所述细胞培养反应器中心轴线的平面上的任一方向往复平移；

所述振荡为沿平行于所述细胞培养反应器中心轴线的任一方向往复平移。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预设的方式为绕偏离所述细胞培养反应器中心的轴线进行偏心回转。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述偏心回转直径小于所述细胞培养反应器的半径，和/或，

所述偏心回转转速为100~400转/分钟。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的培养的时间为24~80小时；

和/或，步骤（2）所述的培养的时间为48~110小时；

和/或，步骤（3）所述的培养的时间为48~160小时；

和/或，步骤（4）所述的培养的时间为48~210小时。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，每隔20~24小时更换培养液一次，所述更换培养液为将全部的培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液，步骤（2）、步骤（3）以及步骤（4）中，每隔20~24小时更换培养液一次，所述更换培养液为将40~60%培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液；

或者，步骤（1）中，每隔20~24小时更换培养液一次，所述更换培养液为将全部的培养液更换为与原培养液组成相同的新鲜培养液，步骤（2）、步骤（3）以及步骤（4）中，采用所述细胞培养反应器进行连续换液。