[发明专利]干细胞分化诱导为肝细胞的方法

说明书

本申请公开了一种干细胞分化诱导为肝细胞的方法。本申请中，方法包括步骤：步骤(1)，在添加有Activin A和Wnt信号通路激动剂的第一培养基中培养干细胞，收集细胞；和步骤(2)，在添加有BMP2和FGF4的第二培养基中培养步骤(1)所得的细胞，收集细胞；和步骤(3)，在添加有HGF和KGF的第三培养基中培养步骤(2)所得的细胞，收集细胞；和步骤(4)，在添加有Vc、EGF和胰岛素的第四培养基中培养步骤(3)所得的细胞，收集细胞，获得所述肝细胞，本发明提供的干细胞分化诱导为肝细胞的方法，通过加入特定的细胞因子和小分子化合物的组合可成功实现诱导干细胞分化为肝细胞。

技术领域

本发明实施例涉及生物医药领域，特别涉及干细胞分化诱导为肝细胞的方法。

背景技术

获得肝细胞是构建人工肝、临床前药物代谢与肝毒性评估、肝再生医学种子细胞规模生产的技术的关键，然而人体来源的肝细胞受限于供体数量有限、体外扩增能力弱以及容易去分化丢失功能等缺陷难以满足对肝细胞日益扩大需求。

多能干细胞具备体外无限增殖及分化为人肝细胞的能力，现有技术中，多能干细胞分化诱导肝细胞的方法主要为单层贴璧生长法。然而单层贴壁状态下的干细胞缺乏细胞间立体广泛的联系，分化获得的肝细胞功能较弱，且分化限制于培养板面积难以收获大量细胞，不适于肝细胞的规模制备。因此，寻找一种可规模化的、稳定的、简便且低成本的干细胞分化诱导为肝细胞的方法成为解决人体来源肝细胞供应不足问题的关键。

发明内容

如本发明所用，术语“诱导性多能干细胞”指的是获得分化多能性的细胞，即通过对体细胞转入赋予分化多能性的几种转录因子基因而获得与胚胎干细胞同等分化多能性的细胞。

本发明实施方式的目的在于提供一种可规模化的、稳定的、简便且低成本的干细胞分化诱导为肝细胞的方法。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种干细胞分化诱导为肝细胞的方法，所述方法包括步骤：

步骤(1)，在添加有Activin A和Wnt信号通路激动剂的第一培养基中培养干细胞，收集细胞；和

步骤(2)，在添加有BMP2和FGF4的第二培养基中培养步骤(1)所得的细胞，收集细胞；和

步骤(3)，在添加有HGF和KGF的第三培养基中培养步骤(2)所得的细胞，收集细胞；和

步骤(4)，在添加有Vc、EGF和胰岛素的第四培养基中培养步骤(3)所得的细胞，收集细胞，获得所述肝细胞。

在一些优选的方案中，在所述第一培养基中，所述Activin A的含量不小于10ng/mL，更优选为不小于30ng/mL，进一步优选为80～120ng/mL，最优选为90～110ng/mL，例如100ng/mL；

在所述第一培养基中，所述Wnt信号通路激动剂的含量不小于0.1μM，更优选为不小于1μM，进一步优选为1～4μM，例如2μM；

在所述第二培养基中，所述BMP2的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于5ng/mL，进一步优选为5～30ng/mL，最优选为10～20ng/mL，例如20ng/mL；

在所述第二培养基中，所述FGF4的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于10ng/mL，进一步优选为10～40ng/mL，最优选为20～35ng/mL，例如30ng/mL；

在所述第三培养基中，所述HGF的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于5ng/mL，进一步优选为5～30ng/mL，最优选为10～20ng/mL，例如20ng/mL；

在所述第三培养基中，所述KGF的含量不小于1ng/mL，更优选为不小于5ng/mL，进一步优选为5～30ng/mL，最优选为10～20ng/mL，例如20ng/mL；