[发明专利]一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用。该方法基于固定化酶的角度，以固定化酶进而提高蛋白的耐受性和重复利用性。其次本发明通过二价金属离子与组氨酸标签的结合实现对蛋白的纯化和固定化，进而提高目标蛋白的酶活。该方法的过程简单，价格低廉，用于含组氨酸标签的蛋白的分离纯化和固定化的操作简单，时间较短，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及微生物固定化领域，具体涉及一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用。

背景技术

蛋白质固定化是指利用物理、化学或生物方法将蛋白质固定在材料表面，并使其保持活性的过程，由于蛋白质分子固有的不稳定性、易变性，使蛋白质的固定化显得尤其重要。

蛋白质的固定化主要分为定向固定和非定向固定两大类。传统的固定化方式主要为非定向，如物理吸附法，包埋法或利用蛋白质天然的基团如氨基、羧基与材料表面基团反应实现固定化。蛋白的非定向固定使蛋白的活性部位得不到充分暴露，从而降低蛋白的活性。

蛋白质的定向固定主要有：抗原/抗体的特异性亲和作用；通过分子生物学手段改造蛋白质从而进行固定化；通过材料表面与蛋白质之间相互反应的基团实现蛋白质在材料表面的定向固定。这些传统方法具有蛋白质需要纯化，需要外源催化剂，需要引入功能基团等。

L-赖氨酸脱羧酶（CadA）可以将L-赖氨酸直接转化为1，5-戊二胺，1，5戊二胺是一种重要的平台化学品，可用于生产聚酰胺，但L-赖氨酸脱羧酶的不可回收性和pH耐受性较差影响了其应用。

发明内容

针对蛋白质的pH耐受性较差和不可收性，以及现有固定化蛋白质技术的不足，本发明提供了一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用，本发明通过钴离子与L-赖氨酸脱羧酶上的组氨酸标签结合对其进行纯化和固定化，减少了对蛋白的纯化过程以及外源添加物的引入，使操作变得简单且成本低廉，同时提高了蛋白质的酶活， pH耐受性，以及通过介孔ZIF的再次包裹实现其重复利用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1，收集培养得到的表达含组氨酸标签的酶的菌株，用pH 5-9的缓冲液A重悬至10-30 OD后，超声破碎仪破碎，离心去除杂质，得到粗酶液；

步骤2，将粗酶液置于缓冲液B中配置成浓度为0.5-2.0g/l的粗酶液，搅拌均匀，加入20-80mmol/l的二价金属离子溶液B，继续搅拌，洗涤后，冻干得酶粉；

步骤3，取步骤2中酶粉5-20mg溶于去离子水中，加入高分子聚合物溶液，搅拌均匀，加入二价金属离子溶液A和二甲基咪唑溶液，继续搅拌，洗涤后，冻干得到所需纯化并固定化的蛋白粉，所述高分子聚合物：二价金属离子溶液A：二甲基咪唑溶液的摩尔比为7：100：400。

作为改进的是，步骤1中缓冲液A的pH为7.0-7.2，缓冲液A为Tris-盐酸缓冲液。

作为改进的是，步骤1中所述含组氨酸标签的酶的菌株为含组氨酸标签的α-碳酸酐酶或含组氨酸标签的L-赖氨酸脱羧酶。

作为改进的是，步骤1中超声破碎仪的功率为300W，破碎过程为间歇式破碎。

作为改进的是，步骤2中缓冲液B为Tris-盐酸缓冲液，粗酶液的终浓度为1g/l，二价金属离子溶液B为终浓度为40mM的钴离子溶液，搅拌时间为30 min。

作为改进的是，步骤3中酶粉溶解后酶液的终浓度为0.5 g/l，高分子聚合物为MW10000的聚乙烯吡咯烷酮，终浓度为35 mg/ml，金属离子A为钴离子、铜离子或锌离子，且终浓度为50mM，二甲基咪唑的终浓度为200mM，搅拌时间为30min。

上述纯化并固定化的蛋白粉在催化L-赖氨酸降解上的应用。