[发明专利]胰腺细胞的扩增和分化方法以及应用

权利要求书

1.一种胰腺细胞的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：获取胰腺组织，所述胰腺组织来源于哺乳动物的胰腺导管；

S2：对所述胰腺组织依次进行消化处理、重悬处理和不连续密度梯度离心处理后，收集各密度梯度交界处的细胞团，然后去除所述细胞团中的胰岛细胞和腺泡细胞，得到原代细胞；

S3：采用扩增培养基对所述原代细胞进行扩增处理，以诱导所述原代细胞重编程，得到胰腺前体样细胞；

所述扩增培养基包括由若干小分子化合物组成的重编程物质，所述重编程物质包括生长因子、Rock信号通路抑制剂、WNT信号通路激动剂和TGF-β信号通路抑制剂。

2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述胰腺组织来源于人胰腺导管。

3.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述生长因子包括表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子中的至少一种，所述扩增培养基中，所述表皮细胞生长因子、所述肝细胞生长因子和所述成纤维细胞生长因子中的任意一种的含量为5-100纳克/毫升。

4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述扩增培养基中，所述Rock信号通路抑制剂的含量为2-15微摩尔/升，所述WNT信号通路抑制剂的含量为2-10微摩尔/升，所述TGF-β信号通路抑制剂的含量为0.5-20微摩尔/升。

5.根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于，所述Rock信号通路抑制剂为Y27632、Fasudil、Thiazovivin和SB-772077-B中的至少一种，所述WNT信号通路激动剂为重组WNT蛋白、重组R-spondin蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂中的至少一种，所述糖原合成酶激酶3β抑制剂为BIO、CHIR99021和TWS119中的至少一种，所述TGF-β信号通路抑制剂为A83-01、RepSox和SB431542中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述扩增培养基还包括基础培养基、血清和无血清神经元添加物，所述扩增培养基中，所述血清和所述无血清神经元添加物的总体积百分比不高于15％，所述血清的体积百分比为2-10％。

7.根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，所述重编程物质还包括脂类信号物质，所述扩增培养基中，所述脂类信号物质的含量为0.5-10微摩尔/升。

8.根据权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，所述脂类信号物质为1-磷酸鞘氨醇和溶血磷脂酸中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述基础培养基为MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640、CMRL1066、WilliamE、Neurobasal和Fischers培养基中的至少一种，所述血清为胎牛血清，所述无血清神经元添加物为N2添加剂和B27添加剂中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述步骤S2中，使用至少三种具有不同密度的分层剂进行所述不连续密度梯度离心处理，相邻所述分层剂分别为低密度分层剂和高密度分层剂，所述低密度分层剂的密度相对所述高密度分层剂的密度下降0.1-3％。

11.根据权利要求10所述的扩增方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述至少三种具有不同密度的分层剂中，密度最高的分层剂的密度不高于1.1克/毫升，密度最低的分层剂的密度不低于1.03克/毫升。

12.一种胰腺前体样细胞的分化方法，其特征在于，所述胰腺前体样细胞由权利要求1-11中任一项所述的扩增方法得到，将所述胰腺前体样细胞接种于培养容器中，然后通过分化培养基诱导所述胰腺前体样细胞分化为胰岛样细胞。