[发明专利]胰腺细胞的扩增和分化方法以及应用

说明书

本发明提供了一种胰腺细胞的扩增方法，包括对胰腺组织依次进行消化处理、重悬处理、不连续密度梯度离心处理和扩增处理。本发明的所述扩增方法使用哺乳动物的胰腺导管作为胰腺前体样细胞的来源，并在所述不连续密度梯度离心处理后去除得到的细胞团中的胰岛细胞和腺泡细胞，有利于提高所述胰腺前体样细胞的得率，避免由于使用胚胎干细胞而带来的伦理方面的限制和可能带来的致癌风险；使用的扩增培养基包括由若干小分子化合物组成的重编程物质，能够避免由于使用基因编辑方法改变基因序列而容易造成的非特异性及脱靶缺失等风险。本发明还提供了经所述扩增方法得到的胰腺前体样细胞的分化方法和应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及胰腺细胞的扩增和分化方法以及应用。

背景技术

糖尿病是一种以胰岛素分泌不足或周围组织胰岛素抵抗导致的高血糖为特征的慢性代谢紊乱疾病，晚期可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和器官衰竭。药物治疗和胰岛素补充是糖尿病目前最常见的治疗方法，但并不能完全治愈糖尿病，同时难以阻止远期并发症的发生发展。

人类β细胞能够分泌胰岛素，降低血糖，以调节脂肪和蛋白质代谢，而人胚胎干细胞由于具有无限的增殖能力，理论上可以从其产生无限量的人类β细胞，因而近年来备受关注。现有技术中对胚胎干细胞进行逐步诱导能够得到具有胰岛素分泌功能的细胞，但诱导的过程程序复杂，周期长且成本高；另外，由胚胎干细胞诱导得到的细胞团中，具有胰岛素分泌功能的细胞占比一般不会超过30％，后期的纯化过程容易污染细胞团，从而使得到的具有胰岛素分泌功能的细胞具有潜在的致癌风险。因此，找到切实有效的胰岛细胞的替代细胞并获得足够数量的可用于细胞替代治疗的种子细胞刻不容缓。

因此，有必要开发一种新型的胰腺细胞的扩增和分化方法，以解决现有技术中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胰腺细胞的扩增方法、分化方法以及应用，以提供良好的胰岛细胞的替代选择，避免现有技术中的胚胎干细胞衍生疗法的伦理方面的限制和可能带来的致癌风险，以及由于使用基因编辑方法改变基因序列而容易造成的非特异性及脱靶缺失等风险。

为实现上述目的，本发明的所述胰腺细胞的扩增方法，包括以下步骤：

S1：获取胰腺组织，所述胰腺组织来源于哺乳动物的胰腺导管；

S2：对所述胰腺组织依次进行消化处理、重悬处理和不连续密度梯度离心处理后，收集各密度梯度交界处的细胞团，然后去除所述细胞团中的胰岛细胞和腺泡细胞，得到原代细胞；

S3：采用扩增培养基对所述原代细胞进行扩增处理，以诱导所述原代细胞重编程，得到胰腺前体样细胞；

所述扩增培养基包括由若干小分子化合物组成的重编程物质，所述重编程物质包括生长因子、Rock信号通路抑制剂、WNT信号通路激动剂和TGF-β信号通路抑制剂。

本发明的所述扩增方法的有益效果在于：使用哺乳动物的胰腺导管作为所述胰腺前体样细胞的来源，并采用所述不连续密度梯度离心处理后，去除得到的所述细胞团中的胰岛细胞和腺泡细胞，保证了所述原代细胞中绝大部分细胞为胰腺导管上皮细胞，提高了所述胰腺前体样细胞的得率，同时避免了由于使用胚胎干细胞而带来的伦理方面的限制和可能带来的致癌风险；另外，所述步骤S3的所述扩增培养基包括由若干小分子化合物组成的重编程物质，且所述重编程物质包括生长因子、Rock信号通路抑制剂、WNT信号通路激动剂和TGF-β信号通路抑制剂，能够通过诱导所述原代细胞重编程的方式得到胰腺前体样细胞，避免了由于使用基因编辑方法改变基因序列而容易造成的非特异性及脱靶缺失等风险。

优选的，所述胰腺组织来源于人胰腺导管。