[发明专利]CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的由CRISPR介导的一步式恒温扩增目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）使用前向外引物、后向外引物、前向内引物、后向内引物、前向环状引物、后向环状引物对待扩增的靶基因模板进行环介导的恒温扩增，其中，在前向内引物或后向内引物中引入PAM位点；

（2）将步骤（1）获得扩增产物与由特异性识别PAM位点的gRNA和AapCas12b因子组成的复合物、末端标记荧光基团的单链DNA探针进行CRISPR-CAS核酸切割反应；

（3）检测步骤（2）的核酸切割反应的结果；

其中，步骤（1）中所述前向外引物的序列如SEQ ID NO.1所示，后向外引物的序列如SEQID NO.2所示，前向内引物的序列如SEQ ID NO.3所示，后向内引物的序列如SEQ ID NO.4所示，前向环状引物的序列如SEQ ID NO.5所示，后向环状引物的序列如SEQ ID NO.6所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.7所示；或者

所述前向外引物的序列如SEQ ID NO.8所示，后向外引物的序列如SEQ ID NO.9所示，前向内引物的序列如SEQ ID NO.10所示，后向内引物的序列如SEQ ID NO.11所示，前向环状引物的序列如SEQ ID NO.12所示，后向环状引物的序列如SEQ ID NO.13所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.14所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）的工作温度均在56ºC-61ºC之间。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）的工作温度均为58ºC或59ºC。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）检测的方法为实时荧光法检测，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.15所示，在所述单链DNA探针标记荧光基 团的相对方向的末端标记有荧光淬灭基团。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）检测的方法为测流生物传感器检测，在所述单链DNA探针标记荧光基 团的相对方向的末端标记有生物素，所述测流生物传感器为一平板状结构的背板，包括用于滴加待检测样品的一样品区、一共轭区、一硝酸纤维素膜和一吸收垫，所述共轭区沉积有作为指示试剂的链霉亲和素固定金纳米粒子，所述硝酸纤维素膜设置有两个带：沉积有兔抗荧光素抗体的对照线和沉积有生物素化牛血清白蛋白的测试线。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.15所示。

7.一组用于权利要求1-3任一所述方法的核酸分子，其特征在于，所述分子包括序列如SEQ ID NO.1所示的前向外引物，序列如SEQ ID NO.2所示的后向外引物，序列如SEQ IDNO.3所示的前向内引物，序列如SEQ ID NO.4所示的后向内引物，序列如SEQ ID NO.5所示的前向环状引物，序列如SEQ ID NO.6所示的后向环状引物，序列如SEQ ID NO.7所示的gRNA，或者

序列如SEQ ID NO.8所示的前向外引物，序列如SEQ ID NO.9所示的后向外引物，序列如SEQ ID NO.10所示的前向内引物，序列如SEQ ID NO.11所示的后向内引物，序列如SEQID NO.12所示的前向环状引物，序列如SEQ ID NO.13所示的后向环状引物，序列如SEQ IDNO.14所示的gRNA。

8.一种含有权利要求7所述核酸分子的检测试剂盒。