[发明专利]CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法

说明书

本发明提供了由CRISPR介导的一步式恒温扩增目的基因的方法以及基于该方法针对SARS‑CoV‑2的ORF1ab和NP基因扩增并检测的核酸分子组合，所述方法将核酸扩增与CRISPR介导的序列特异性检测整合到一个反应中，检测结果可以通过荧光或测流生物传感条。本发明提供的方法具有超灵敏、高度特异性和方便可行性，可作为临床、现场和资源贫乏地区的诊断工具。

技术领域

本发明公开了一种基因恒温扩增方法，属于微生物、更为具体地属于核酸的测定或者检验的技术领域。

背景技术

冠状病毒疾病2019(Coronavirus disease 2019,COVID-2019)是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的一种高度传染性疾病，已成为全球主要健康威胁之一。尽管基于PCR的检测技术具有较好的分析性能，但该技术用于检测COVID-19仍存在一定的局限性。

近年来，原核生物规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR关联系统 (CRISPR-associated system,CRISPR-Cas)为生物技术应用打开了大门，例如基因组编辑和转录调控。特别是最近发现了在某些Cas效应子中附带爆发式剪切活性，如Cas12a，Cas12b，Cas13a和Cas14，这为新型诊断平台铺平了道路，这些平台可通过核酸传感提供便携式、高度特异性和超灵敏的测试。与基于PCR的检测技术相比，基于CRISPR的诊断降低了对专用仪器的依赖性，并且可以在生理温度，甚至室温下进行。当前，已经设计并验证了几种非常有前景的基于CRISPR的检测技术。据报道，基于CRISPR-Cas12a的靶向DNA核酸内切酶的CRISPR Tans报告子(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Tans Reporter,DETECTR)和一小时低成本的多功能高效系统(One-Hour-Low cost Multipurpose highly Efficient System,HOLMES)可检测人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)和单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism,SNPs)。同时，开发了一种基于CRISPR-Cas14的DETECTR检测方法来诊断HPV，以及针对登革病毒(Dengue virus,DENV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)和HPV设计了基于CRISPR-Cas13a的特异的高灵敏性酶促报告解锁 (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing,SHERLOCK) 检测方法，其具有单碱基错配特异性和attomolar敏感性。

已开发的基于CRISPR的检测方法通过两个连续步骤来实现核酸检测：(1)使用PCR或等温扩增测定法，如重组聚合酶扩增和环介导的等温扩增技术扩增靶核酸。(2)通过基于CRISPR剪切活性的检测结果报告。因此，所有基于CRISPR的检测开发都涉及两个独立的反应步骤(预扩增和CRISPR介导的检测)和多个手动操作及扩增产物的处理。这些步骤不仅使过程复杂化，而且增加了交叉污染的风险，这阻碍了其在各个领域的广泛应用。此外，为了激活Cas效应蛋白，gRNA识别靶序列必须设置在适当的位置，该位置含有前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif,PAM)位点。因此，这些开发的基于CRISPR的检测技术不足以检测不含PAM位点的核酸。

快速、经济、准确的核酸检测技术在病原菌检测、疾病诊断和环境检测中具有重要应用价值。为了克服传统CRSPIR检测方法的缺陷，本发明的目的是提供一种新的CRISPR介导一步式检测方法(简称 CRISPR-top)，并将其应用于SARS-CoV-2的检测。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种由CRISPR介导的一步式恒温扩增目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：